【摘 要】
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目的:通过建立稳转细胞系,探究Ⅰ型(HSV1)和Ⅱ型(HSV2)基因产物对重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(o HSV2)复制的影响。方法:合成HSV1-ICP34.5和HSV2-ICP34.5基因序列,连接至Piggy Bac-Dual-promoter(PBDP)真核表达载体上,并通过测序进行确认。将重组真核表达载体转染到Vero细胞和BHK细胞,构建表达ICP34.5基因的稳转细胞系。用荧光显微镜及流式
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目的:通过建立稳转细胞系,探究Ⅰ型(HSV1)和Ⅱ型(HSV2)基因产物对重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(o HSV2)复制的影响。方法:合成HSV1-ICP34.5和HSV2-ICP34.5基因序列,连接至Piggy Bac-Dual-promoter(PBDP)真核表达载体上,并通过测序进行确认。将重组真核表达载体转染到Vero细胞和BHK细胞,构建表达ICP34.5基因的稳转细胞系。用荧光显微镜及流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP,为稳转成功指示蛋白)的表达,用PCR扩增、实时荧光定量PCR及免疫印染来鉴定ICP34.5目的基因及表达。再用稳转细胞系来生产o HSV2病毒,通过CCID50方法检测病毒滴度来评估ICP34.5蛋白对o HSV2复制的影响。结果:共获得4种稳转细胞系,分别为VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5和BHKHSV2-ICP34.5;4种新稳转细胞系于荧光显微镜下均能观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达,流式检测阳性细胞比例达到百分之九十以上;4种新稳转细胞系经免疫印染检测均能表达ICP34.5蛋白,用PCR扩增和荧光定量PCR都能鉴定出ICP34.5基因;病毒生产及滴度结果显示,VeroHSV1-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5和BHKHSV2-ICP34.5三种细胞和对照细胞比较,均能促进o HSV2的复制,提高病毒的滴度,统计学分析有显著性差异(P值分别为0.0109、0.0484、0.0125),而VeroHSV2-ICP34.5与对照细胞比较有促进o HSV2病毒复制的趋势,但统计学分析无显著性差异(P值为0.1506)。结论:成功构建稳定表达ICP34.5基因的新细胞系(Vero HSV1-ICP34.5细胞、Vero HSV2-ICP34.5细胞、BHKHSV1-ICP34.5细胞和BHKHSV2-ICP34.5细胞);ICP34.5蛋白可增强重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(o HSV2)复制,提高o HSV2病毒滴度。
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