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目的：
以腺病毒为载体的基因治疗疗效备受争议。在大多数情况下，腺病毒转染靶细胞依赖于其主要受体--腺病毒柯萨奇病毒受体(CAR)的表达。然而，在许多恶性肿瘤细胞中CAR的表达水平较低，低水平的CAR表达被认为是以腺病毒为载体的基因治疗疗效不佳的原因之一。因此，提高CAR在肿瘤细胞的表达成为增强腺病毒基因治疗疗效研究中一个非常具有希望的方向。蛋白酶体是真核细胞蛋白降解的主要场所。最近随着一些选择性蛋白酶体抑制剂的问世，为研究泛素．蛋白酶体途径在不同信号通路中的作用提供了可能。目前，尚未见有关蛋白酶体抑制剂类药物对CAR．表达影响的报道。在本研究中，我们运用免疫组化的方法分析了CAR在结肠癌组织中的表达，并进一步分析蛋白酶体抑制剂MG-132对结肠癌细胞株Iovo细胞CAR表达的影响。
方法：
采用免疫组织化学的方法检测CAR在结肠肿瘤中的表达，分析CAR的表达与临床及病理特征之间的关系。预先进行药敏实验以确定MG-132及TSA(trichostatin A，曲古抑菌素，阳性对照用药)对肿瘤细胞株的最低有效剂量。运用流式细胞法、RT-PCR法及western blot法检测CAR在经MG-132或TSA处理前后的表达情况。为进一步定性及定量分析经MG-132或TSA处理后腺病毒的转染效率，我们使用重组增强绿色荧光蛋白腺病毒(tAd．EGFP)转染靶细胞后，采用荧光显微镜及流式细胞仪分析其转染效率。为分析经MG-132或TSA处理后对腺病毒药物体外效果的影响，我们使用重组人p53腺病毒(tAd．p53)或溶瘤型腺病毒转染靶细胞，运用western blot法分析经rAd．p53转染后p53及p21的表达情况，运用MTT法检测溶瘤型腺病毒的体外抗肿瘤效应。
结果：
与瘤旁结肠上皮组织相比，结肠肿瘤组织中普遍存在着CAR的表达丢失或下调(p<0.01)，但CAR在原发灶及淋巴结转移灶中的表达水平并无明显差异。此外，结肠肿瘤组织中CAR的表达丢失或下调还与患者的年龄(p=0.0395)及肿瘤大小(p=0.0115)密切相关。
本实验中MG-132或TSA所用剂量对肿瘤细胞没有或仅有较小细胞毒性。FCM分析lovo细胞经MG-132(1.5umol/L)或TSA(30ng/ml)处理两天后CAR的表达情况，lovo细胞CAR的阳性表达率由处理前的3.4±1.0％分别升至23.5±2.6％和36.5±2.6％。运用RT-PCR及western blot法分析药物处理前后CARmRNA及蛋白质表达的变化发现，lovo细胞经TSA处理后，其CAR mRNA及蛋白质的水平皆得到不同程度的提高。lovo细胞经MG-132处理后并不能提高CAR mRNA的表达水平，但同样也能提高CAR蛋白质的表达水平。我们运用25、50或100 MOI的rAd．EGFP转染lovo细胞证实，经MG-132或TSA处理后能够提高目的基因的表达水平。在50 MOI的情况下，未加药物处理组、MG-132处理组及TSA处理组GFP的表达率分别为：26.5±2.1％、49.7±5.3％和62.1±7.0％。此外，rAd．p53与MG-132或TSA联合应用时，能够明显地提高p53及p21的表达水平。lovo细胞经或不经MG-132或TSA处理后，在体外转染50 MOI的溶瘤型腺病毒，结果显示：药物处理组lovo细胞的生长抑制率较对照组明显提高。
结论：
在结肠肿瘤组织中普遍存在CAR的表达丢失或下调，提示在设计腺病毒载体基因治疗方案时应充分考虑CAR表达变化对疗效的影响。与TSA相比，蛋白酶体抑制剂MG-132在不显示细胞毒性的剂量水平下，同样也能提高lovo细胞CAR的表达水平，并能进一步增强腺病毒对其的转染效率及转染后目的基因的表达水平。采用MG-132预处理后能够提高lovo细胞对腺病毒类药物的敏感性，为增强腺病毒基因治疗的疗效提供了可能。