【摘 要】
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枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(neutral protease),是一类被广泛应用于工业生产的酶类,在洗涤剂、制革、丝绸、食品加工等多种行业上有着广泛的用途。本课题主要是通过体外定向分子
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枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(neutral protease),是一类被广泛应用于工业生产的酶类,在洗涤剂、制革、丝绸、食品加工等多种行业上有着广泛的用途。本课题主要是通过体外定向分子进化技术,改造nprE基因,从而构建能够高效稳定生产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株。主要结果如下:1.运用PCR技术,从枯草芽孢杆菌标准株扩增出强启动子P43序列和nprE全长基因。克隆到pMD18-T载体中,鉴定了上述基因。标准株nprE序列与已公布序列完全相同。2.鉴定了产蛋白酶效率较高的11株分离株,PCR扩增得到其中8株的nprE全长基因。3.构建枯草芽孢杆菌原核表达载体pNP43-nprE,重组质粒转化枯草芽孢杆菌168菌株,并在枯草芽孢杆菌中表达,12%SDS-PAGE电泳分析,重组菌可表达分子量分别约为42kDa的蛋白。经抗生素压力选择后,表达量在OD600为0.8时,酶产量出现最高,粗酶液酶活力达到了出发菌株的3倍。3.以nprE全长基因为出发点,应用基因家族改组(Familly DNA Shuffling)技术,以标准株和野生型菌株的nprE基因作为材料,对其进行突变。在酶产率未提高的情况下,第一轮筛选,突变株酶活力提高了126%,以第一轮筛选的高活力突变株为基础进行第二轮突变和筛选,酶活力又提高了将近90%,且能够稳定遗传。分析表明,nprE基因的碱基发生了改变。这种改变引起了其产物中性蛋白酶分子的氨基酸的改变,从而造成酶活力的改变。通过比较,发现应用表达载体在抗生素压力下提高了酶的产量。定向进化则改变了基因结构从而提高了酶活力,相比表达载体更为经济和稳定。
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