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目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)后处理对低糖/高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响,并探讨CGRP的保护机制。方法:1.心肌细胞培养、鉴定方法及建立H/R模型。选取健康出生72小时以内的SD大鼠,取出并剪碎心脏,Ⅱ型胶原酶反复消化数次,离心后取上清接种于六孔细胞培养板培养72小时。对心肌细胞特有的横纹肌肌动蛋白使用免疫组化SABC法对心肌细胞进行鉴定。培养72小时后,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,缺氧/复氧结束之后使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率。2.CGRP对乳鼠心肌细胞H/R损伤的影响。将培养72小时的心肌细胞选取12孔细胞进行实验并随机分成四组(n=3):(1)对照组:不处理不加药;(2)H/R组:更换缺氧液缺氧3小时,更换DMEM复氧2小时;(3)H/R+CGRP组:更换缺氧液缺氧3小时,更换含有10-8mmol/L CGRP的DMEM,复氧2小时;(4)H/R+CGRP+CGRP8-37组:提前1小时更换含有10-7mmol/L的CGRP8-37的DMEM,更换缺氧液缺氧3小时,更换含有10-8mmol/L的CGRP的DMEM,复氧2小时。将四组心肌细胞按照以上方法处理后,使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率;收集上清液,ELISA法测定各孔心肌细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的浓度。3.CGRP对原代培养乳鼠心肌细胞H/R损伤保护的机制。按照方法2进行分组及处理,使用JC-1测定心肌细胞线粒体膜电位(MMP)变化,使用Fluo-3 AM和Rhod-2AM分别测定细胞内及线粒体内的钙浓度,使用DCFH-DA测定细胞内的活性氧浓度。4.CGRP对高糖孵育心肌细胞H/R损伤的影响。心肌细胞分别用低糖DMEM及高糖DMEM孵育,将培养72小时的心肌细胞选取15孔进行实验并随机分成5组(n=3):(1)低糖对照组(LG):心肌细胞全程使用低糖DMEM孵育,不进行缺氧/复氧的处理,不更换缺氧液,也不添加任何药物的干预;(2)高糖对照组(HG):心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,不进行缺氧/复氧的处理,不更换缺氧液,也不添加任何药物的干预;(3)高糖缺氧/复氧组(HG+H/R):心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,不添加任何药物的干预;(4)HG+H/R+CGRP组:心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,在缺氧结束后复氧开始前更换DMEM时加入CGRP(10-8mmol/L);(5)HG+H/R+CGRP+CGRP8-37组:心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,提前1小时加入CGRP8-37(10-7mmol/L),缺氧3小时,更换DMEM时加CGRP(10-8mmol/L)复氧2小时。将五组心肌细胞按照以上方法处理后,使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率;收集上清液,ELISA法测定各孔心肌细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的浓度。5.CGRP对高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤保护的机制。按照方法4进行分组及处理,使用Fluo-3 AM和Rhod-2 AM分别测定细胞内及线粒体内的钙浓度,使用DCFH-DA测定细胞内的活性氧浓度。结果:1.心肌细胞培养成功,在显微镜下观察、拍照并计数,所需心肌细胞的数量占所有细胞数量总和的90%以上。2.成功建立H/R损伤,凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。3.H/R组心肌细胞凋亡率、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度、培养基中LDH和caspase-3的浓度比对照组明显升高(P<0.05),MMP明显下降(P<0.05);通过与H/R组的对比,观察H/R+CGRP组心肌细胞的凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内的活性氧浓度、细胞内及线粒体内的钙浓度均明显下降(P<0.05),MMP明显升高(P<0.05);并且CGRP的特异性拮抗剂CGRP8-37可以逆转CGRP对缺氧/复氧心肌细胞的作用。4.与LG组比较,HG组心肌细胞凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞内及线粒体内的钙浓度均明显升高(P<0.05);与HG组比较,HG+H/R组心肌细胞凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度均明显升高(P<0.05);与HG+H/R组比较,HG+H/R+CGRP组心肌细胞的凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度均明显下降(P<0.05);并且CGRP的特异性拮抗剂CGRP8-37可以逆转CGRP对缺氧/复氧心肌细胞的作用。结论:1.心肌细胞经过H/R处理后导致细胞损伤,CGRP后处理可以减轻H/R对心肌细胞的损伤,CGRP8-37可以逆转CGRP的作用。2.高糖DMEM孵育对心肌细胞造成了损伤,缺氧/复氧可以加重高糖孵育心肌细胞的损伤,CGRP后处理可以减轻高糖孵育心肌细胞的缺氧/复氧损伤,CGRP8-37可以逆转这种保护作用。3.CGRP发挥心肌保护作用的机制与其升高MMP、降低细胞内及线粒体内钙浓度和细胞内活性氧浓度有关。