L-抗坏血酸对小鼠卵母细胞和胚胎发育的作用及其机制研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lcc2451
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获取高质量成熟的卵母细胞和胚胎是进行人工辅助生殖和动物生产的关键。相对于体内自然发育的条件,体外培养条件会导致卵母细胞和胚胎在成熟和发育过程中出现异常的表观遗传修饰,从而会导致卵母细胞和胚胎发育率以及发育质量的下降,严重的甚至会引起卵母细胞和胚胎的死亡;维生素C是人类必需的营养物质,最近的研究发现它能广泛地影响表观遗传修饰,并且可以提高胚胎的发育率。然而,维生素C在卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用及其影响胚胎发育的机理仍有待研究。例如:维生素C能否影响小鼠卵母细胞的发育率、提高小鼠卵母细胞和胚胎的发育质量、改善因体外培养条件而带来的异常的表观遗传修饰等。本实验利用卵母细胞和胚胎体外细胞培养、细胞免疫荧光、Western blot、实时荧光定量PCR等技术,检测了维生素C对于小鼠卵母细胞和胚胎体外培养发育的影响,探讨了L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞和胚胎体外培养最佳的处理浓度。主要实验结果如下:1.不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后,导致GVBD率都出现了下降;50ug/ml处理组显著提高了第一极体排放率(P<0.05):100uf/ml处理组显著降低了第一极体排放率(P<0.05);200ug/ml和1000ug/ml显著降低了GVBD率(P<0.05);2.免疫荧光结果显示:100ug/mlL-Ascorbic acid处理卵母细胞,导致了染色体排列出现异常,排列较为松散:200ug/ml和1000ug/mlL-Ascorbic acid处理卵母细胞后,染色体排列出现了明显的异常,纺锤体组装也出现了异常;3.不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后,各个处理组甲基化蛋白DNMT1表达量均出现上升;100ug/ml处理浓度开始差异性显著(P<0.05);小鼠卵母细胞5-mc免疫荧光结果图显示,200ug/ml和1000ug/ml处理均能显著提高卵母细胞5-mc水平(P<0.05);4.体内成熟卵母细胞纺锤体检验点蛋白BubRl低于体外培养的小鼠卵母细胞;50 ug/ml处理显著性的降低体外培养卵母细胞BubRl蛋白的表达量,接近于体内BubR1蛋白的表达量;100 ug/ml处理组和1000ug/ml处理组著地降低了体外培养卵母细胞纺锤体检验点相关蛋白BubRl蛋白的表达量(P<0.01);5.不同浓度的L-Ascorbic acid处理对体外培养卵母细胞通路蛋白P-ERK表达量的影响:50ug/mlL-Ascorbic acid处理组降低了P-ERK表达量;100ug/ml处理浓度开始,P-ERK蛋白的表达量显著的上升(P<0.05);6. RT-PCR结果显示小鼠卵母细胞中主要起作用的去甲基化基因是TET3,不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后,甲基化基因DNMT1和去甲基化基因TET3的mRNA水平均上升;全能性基因Kif4的mRNA水平均下降; 100ug/ml处理后OCT4mRNA水平高于对照组,但差异性不显著;其他处理组mRNA水平均下降;7.2cell时期体内胚胎5-mc水平高于体外培养胚胎,5-hmc水平体内胚胎显著高于体外培养胚胎(P<0.05);8cel1、Morula、Blastula时期体外培养胚胎5-mc水平显著高于体内胚胎(P<0.01);8cel1、Blastula时期体外培养胚胎5-hmc水平显著高于体内胚胎(P<0.01),Morula时期体外培养胚胎5-hmc水平高于体内胚胎,差异不显著;8.Morula时期,体内胚胎去甲基化基因TET2 mRNA水平要显著高于体外培养胚胎(P<0.05);TET3主要在2ce11时期起作用,体内胚胎TET3 mRNA的水平显著高于体外培养胚胎(P<0.05);9.50ug/ml浓度L-Ascorbic acid可以显著提高2ce11、8ce11(P<0.05);Morula、 Blastula(P<0.01)时期的胚胎发育率。
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