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研究目的:分别用SD大鼠和Neuro-2a(N2a)细胞系建立铅暴露动物模型和细胞模型,研究铅对神经细胞的损伤效应,明确细胞自噬异常在铅诱导神经细胞凋亡过程中的作用,探索TFEB在铅诱导自噬异常及细胞凋亡中的作用。研究方法:1.建立铅暴露动物模型,铅暴露组大鼠饮用含有300 ppm醋酸铅水溶液5周,对照组饮用去离子水。模型建立结束后,原子吸收分光光度法检测大鼠血铅和脑铅水平;水迷宫实验检测铅暴露对大鼠学习记忆功能的影响;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达水平。2.建立铅暴露体外细胞模型,使用含有50 μmol/L醋酸铅的培养液处理N2a细胞;采用CCK-8法检测铅处理后不同时间点的细胞活性;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达水平。3.Western blot法检测铅暴露后海马组织和N2a细胞中自噬相关蛋白表达水平;免疫荧光法观察铅暴露后N2a细胞自噬的改变;使用细胞自噬抑制剂3-MA,观察抑制自噬对铅诱导细胞凋亡的影响。4.Western blot法检测铅暴露对大鼠海马组织和N2a细胞中TFEB表达水平的影响;采用siRNA技术抑制TFEB的表达,Western blot法检测自噬及凋亡相关蛋白的表达改变情况。研究结果:1.铅暴露对神经细胞凋亡的影响与对照组相比,铅暴露组大鼠血铅和脑铅水平显著升高(P<0.05);水迷宫实验结果发现铅暴露组大鼠空间记忆能力显著下降;Western blot结果显示,铅暴露后大鼠海马组织中Caspase-3剪切体蛋白表达水平升高。体外实验也证实,铅暴露后N2a细胞活力呈时间依赖性降低(P<0.05);并伴随Caspase-3剪切体蛋白表达水平升高。提示铅暴露可以引起神经细胞的凋亡。2.自噬异常在铅暴露诱导神经细胞损伤中的作用Western blot结果显示,铅暴露后海马组织和N2a细胞中自噬相关蛋白Atg5表达水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均显著增高;免疫荧光实验结果显示,铅暴露后N2a细胞LC3聚集泡的数量比对照组显著增加。TUNEL染色和Western blot结果显示:使用细胞自噬抑制剂(3-MA)处理细胞,可以减少铅暴露引起的N2a细胞凋亡,并降低了铅暴露后Caspase-3剪切体的蛋白表达水平。提示抑制细胞自噬可以减少铅暴露诱导的神经细胞凋亡。3.TFEB对铅暴露诱导神经细胞自噬和凋亡的调控作用铅暴露后大鼠海马组织和N2a细胞中,Western blot结果均显示TFEB的表达水平显著升高;使用siRNA技术抑制TFEB的表达后,可以导致N2a细胞LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Atg5蛋白和Caspase-3剪切体蛋白表达水平增高,提示TFEB可能参与了铅诱导的细胞自噬及凋亡的调控。结论:1.铅暴露导致大鼠海马组织和N2a细胞凋亡增加和自噬水平增强,抑制自噬可缓解铅暴露导致的神经细胞凋亡,显示铅诱导的自噬在神经细胞凋亡中发挥了调控作用;2.铅暴露可诱导TFEB表达增加,抑制TFEB表达可使铅诱导的细胞自噬和凋亡增加,表明TFEB可调控铅暴露诱导的神经细胞自噬和凋亡的发生。