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研究背景:亚临床甲状腺功能减退症(Subclinical hypothyroidism,SCH)简称为亚甲减或亚临床甲减,是多病因导致的一组综合征。其血清学特点是游离甲状腺素(FT4)在正常范围内而仅仅是促甲状腺激素(TSH)水平较正常范围升高。流行病学调查研究显示,近年来亚甲减发病率呈逐年上升趋势,西方发达国家的发病率约为4%-20%,在亚洲国家的发病率更高,高达17%-20%。尽管SCH临床症状轻微或不显著,但大量研究报道SCH经常伴有血脂紊乱,并且是冠心病和非酒精性脂肪肝的独立危险因素。在SCH的进程中常伴有不同程度的脂质代谢紊乱,但其分子机制尚不十分清楚,而肝脏在脂代谢进程中发挥了关键性作用,是脂质代谢的核心场所之一,因此肝脏可以作为研究亚甲减脂质代谢紊乱的靶器官。近些年来研究发现,MicroRNA(mmiRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的短的非编码RNA,也被称为微小RNA。miRNA部分结合于互补的靶位点,主要在mRNA 3’非翻译区(3’ UTRs),导致mRNA发生降解或翻译抑制。研究报道miRNA在包括非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)等许多种肝脏疾病中进行差异调控,影响肝脏病理生理环境,且miRNA的种类及表达情况具有组织特异性,特定的miRNA反映出体内一些特定的病理及生理过程。然而,目前尚未研究报道miRNA在亚甲减肝脏脂质代谢紊乱中的作用。蛋白质组学研究的是在特定时间内特定的生物体或特定组织中表达蛋白的系统分析和记录。其在组织细胞的整体蛋白质水平上揭示生命活动的基本规律,获得对细胞生理、病理过程及调控网络的全面而深入的了解。蛋白质组学作为基因组学研究的拓展,在世界生命科学领域的科学研究中成为一个极其重要的组成部分。蛋白质组学在脂质代谢研究中具有广泛的应用,而基于质谱技术的第二代无凝胶同位素标签相对和绝对定量(Isobaric Tags For Relative And Absolute Quantitation,iTRAQ)蛋白质组学分析能给出更精确的蛋白质水平定量,分析结果灵敏、可靠,可以同时给出每一个蛋白的分子量和丰富的结构信息;此外液相色谱一串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)检测灵敏度高、界限低。是本课题非常合适的一种研究方法。近些年愈来愈多的研究发现,miRNA对脂代谢的调控作用通过庞大的调控网络得到实现。蛋白质组学已被广泛应用于miRNA调控的生物功能蛋白的鉴定和量化。然而尚未有研究报道亚甲减肝脏中脂代谢相关miRNA表达谱和蛋白质组的特征变化。研究目的:本研究旨在探索小鼠SCH模型中肝脏脂质代谢紊乱相关miRNA表达谱和蛋白质组学的特征变化,对差异表达的miRNA和蛋白质进行深入的生物信息学分析,构建SCH小鼠肝脏中miRNA和蛋白质之间的相互作用模块,以期对SCH小鼠肝脏脂代谢紊乱的发生发展有更加全面的了解和认识,为进一步探索SCH脂代谢紊乱的相关机制奠定分子基础。研究方法:1.小鼠SCH模型的建立:7周龄雄性C57BL/6小鼠适应性喂养一周后,随机分为两组,分别给予甲巯基咪唑(MMI,0.08mg/kg/d)饮水(亚甲减组)和普通饮水(对照组)。MMI喂养16周后,采用ELISA的方法检测小鼠血清促甲状腺激素(TSH)水平,采取I125标记放免法测定小鼠的血清中游离甲状腺素(FT4)水平评估小鼠的血清甲状腺功能。通过检测小鼠的血清肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)排除药物对肝脏产生的副作用。2.血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)采用山东省立医院内分泌实验室全自动生化分析仪检测;肝组织TG和TC含量测定按照北京普利莱公司生产的检测试剂盒规范操作。肝脏油红0染色评估小鼠肝脏脂质沉积情况。3.实时荧光定量PCR(qPCR)检测小鼠肝脏中脂代谢相关miRNA表达谱的变化。4.iTRAQ试剂标记酶解蛋白联合/LC-MS/MS技术提取小鼠肝脏蛋白,并用软件ProteinPilotTM 4.5得到定量的蛋白质,设定SCH/CON蛋白质表达量>1.80或<0.56为筛选差异表达蛋白上调或下调的界限值。5.利用PANTHER和David分析差异蛋白的生物学功能及参与调节的信号通路。6.采用 Cluster version 3.0 和 Java Treeview 1.6 对 miRNA 表达谱和差异蛋白整体表达模式进行凝聚层次聚类分析。7.利用TargetScan和miRanda两种分析网站寻找差异表达的蛋白中miRNA的靶分子,结果进行重叠,构建miRNA-蛋白质调控模块。结果:1.小鼠SCH模型的建立:SCH的临床特点是血清TSH水平升高,而血清FT4没有超出正常范围。MMI(0.08mg/kg/d)饮水喂养16周后检测到小鼠SCH模型血清TSH水平较对照组小鼠增加明显(P<0.01),但是血清FT4水平在两组小鼠间无显著性差异(P>0.05)。上述变化符合SCH的临床特点和诊断标准。2.SCH小鼠脂质谱异常:血脂(TG、TC、LDL-C)在SCH组小鼠中显著高于对照组小鼠(P<0.05),而血清HDL-C水平在SCH组和对照组无显著差异(P>0.05)。SCH小鼠肝脏中TC及TG的含量也有明显增加(P<0.05);油红0染色显示:SCH小鼠肝脏中脂质聚集也增多。3.入选的 17 个 mi croRNAs 表达谱变化:miR-1 0b-5p、mi R-24-3p、miR-29a-3p、miR-30b-5p、miR-34a-5p、miR-125b-5p、miR-130a-5p 及 miR-199a-5p 在小鼠SCH小鼠肝脏中表达显著下调(P<0.05),差异有统计学意义。对17个脂代谢相关miRNAs分层凝聚聚类分析,结果显示:各组大部分个体可以聚在一起,9只SCH小鼠中8只可以聚在一起,7只对照组小鼠中6只可以聚在一起。4.小鼠肝脏蛋白质表达谱的变化:iTRAQ定量蛋白质组学研究结果显示,在SCH组和对照组中得到1969个蛋白的定量结果,设定SCH/CON蛋白质表达量>1.80或<0.56为显著差异表达的界限值,发现有36个蛋白发生了显著性的差异表达,其中表达上调的有22个,表达下调的有14个。GO分析结果显示,大多数蛋白与“新陈代谢”和“细胞过程”相关,并且是位于细胞及细胞器中的结合蛋白或具有催化活性的蛋白。我们进一步通过KEGG分子通路分析显示:大多数差异蛋白参与阿尔兹海默病、氧化磷酸化、帕金森病以及非酒精性脂肪肝等多条通路的调控。基于差异蛋白质的分层聚类显示:两组具有显著的分离,表明SCH小鼠和对照小鼠肝脏蛋白表现出明显不同。5.miRNA-蛋白质调控模块分析:本研究通过生物信息软件分析预测mmiRNA的靶分子,构建了 SCH小鼠肝脏脂代谢相关的差异miRNA和差异蛋白的调控模块。得到了 3个miRNA,5个蛋白以及5个miRNA-蛋白调控关系。其中miR-34a-5p调控的是 Aldh3a2 和 Txn;miR-130a-3p 调控的是 Eef1b 和 Psap;miR-24-5p 调控的是Selenbp2。结果提示这些miRNAs和蛋白可能参与SCH小鼠肝脏脂代谢紊乱的发生发展。结论及意义:1.小鼠SCH模型存在血脂异常和肝脂代谢紊乱。2.SCH小鼠肝脏miRNA表达谱发生变化:miR-10b-5p、miR-24-3p、miR-29a-3p、miR-30b-5p、miR-34a-5p、mmiR-125b-5p、miR-130a-5p 和miR-199a-5p表达显著下调。3.miR-34a-5p/Aldh3a2,mmiR-34a-5p/Txn,miR-130a-3p/Eef1b,miR-130a-3p/Psap,miR-24-5p/Selenbp2调控关系为SCH脂代谢紊乱发病机制提供分子理论基础。