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虫害是造成农业减产的主要原因之一。化学农药的问世,虽然在对农业持续稳定地发展起到了不可估量的作用,但长期、大量地施用化学农业已经造成一系列严重后果。抗虫基因工程为烟草害虫防治提供了一条新的有效途径。海芋凝集素(Alocasiamacrorrhiza Lectin,简称AML)是从天南星科植物海芋中提取出的一种植物凝集素。利用海芋凝集素进行了抗虫研究,结果表明海芋凝集素粗品对受试昆虫和几种昆虫细胞有较强的毒杀作用,从而显示了AML作为一个新型抗虫蛋白在实际应用中的可能性。本研究采用分子生物学技术构建了超表达海芋凝集素基因的载体,利用农杆菌介导和组织培养技术获得了转基因植株,并对表达AML基因植株的抗虫活性做了初步研究,得出以下主要结果:
1.超表达AML基因载体的构建及遗传转化
将已经克隆出的海芋凝集素cDNA序列分别于强启动子35S和ubi相连,构建了组成型表达AML基因的载体,除此之外还将AML基因与GFP基因相连,构建了可以表达融合蛋白的载体。将载体分别用于转化烟草叶片和水稻愈伤,经筛选、分化后获得转基因植株,后利用了AML基因上的特异引物PCR检测和AML生物活性测定确定目的片段已经整合到了基因组中。
2.转基因植株后代的筛选与鉴定
本实验通过抗生素筛选初步确定了单拷贝株系,并通过RT-PCR分别从转录水平鉴定转基因植株,由此筛选出表达效果理想的单拷贝株系。
3.AML的亚细胞定位
利用AML基因与GFP基因相连表达的融合蛋白可以在特定激发光下显示荧光的特性,在激光共聚焦显微镜下观察阳性株系的根尖细胞,通过野生型对照去除本底表达的荧光信号后观察单个细胞中融合蛋白的分布,从而确定了AML是作为储存蛋白均匀分布于细胞质中。
4.AML基因抗虫活性的初步研究
利用植物材料离体叶片和野外采集的蚜虫若虫进行了转基因材料的抗虫性分析。除此之外,还利用自然状态下发生的虫害观察了转基因材料对于蚜虫和白粉虱等同翅目昆虫的抗性,证实了转AML基因的植物材料确实比野生型植株对于虫害的抵抗性有了较大的提高,从而表明了AML基因在转基因抗虫方面的应用前景。