【摘 要】
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低能离子生物学是当前发展起来的一个新兴学科,前人对低能离子注入与生物体相互作用做了大量研究.但低能离子对生物细胞内DNA靶分子作用造成的损伤、修复及突变仍有许多问题
【出 处】
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中国科学院合肥分院等离子体物理研究所 中国科学院等离子体物理研究所
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低能离子生物学是当前发展起来的一个新兴学科,前人对低能离子注入与生物体相互作用做了大量研究.但低能离子对生物细胞内DNA靶分子作用造成的损伤、修复及突变仍有许多问题尚待阐明.本论文研究目标是建立一种碱基置换突变检测体系,为活细胞内染色体上突变分析提供一种全新、灵敏、有效的实验方法;利用DNA甲基化介导的错配修复系统缺陷型、recA缺陷型等一系列突变菌株,为低能氮离子注入引起DNA损伤类型、修复及其与生物学效应的关系提供分析依据;并尝试验证通过构建甲基化介导的MMR系统关键基因缺陷表达构建子,导入受体细胞,干扰微生物体内相应的修复系统,以提高其诱变率,为此项工作在工业微生物育种应用可行性提供试验依据.利用大肠杆菌利福平抗性突变筛选指标,以rpoB基因抗性决定簇序列单碱基置换突变引起的突变为分析系统,建立了诱变剂诱发大肠杆菌细胞内染色体DNA碱基置换型突变特异性分析体系.经分析表明突变子筛选系统灵敏、高保真PCR扩增突变子相关区域与测序序列分析系统可行、突变类型全面、检测体系效率高.该系统可以应用于碱基置换突变特异性分析.分析了低能氮离子注入与<60>Co-γ射线辐照诱发大肠杆菌AB1157存活与剂量(注量)关系.与<60>Co-γ射线相比,低能氮离子是一种优良的诱变源,对大肠杆菌其具有致死率低,碱基突变频率高的特点.利用甲基化介导的DNA错配型损伤修复缺陷型菌株,研究了低能氮离子注入诱发DNA损伤与修复.MMR途径系列缺陷型菌株的自发突变率与低能氮离子诱发突变频率均大大提高,低能氮离子注入可诱发活细胞内大量DNA错配型损伤,而且,这些损伤主要是由MMR途径修复的,在正常的活细胞中,这种修复活性相当高,大多数损伤均得以正确修复,MMR缺陷型增变效应大小顺序为:dam+dcm>mutS>mutL>dam>dcm.MMR系统缺陷使突变大肠杆菌对低能氮离子注入的超敏感性下降,与大肠杆菌对低能氮离子注入敏感性有关,但并非决定性要素.利用recA缺陷型的菌株,研究了缺陷型背景下,低能氮离子注入细胞DNA损伤、突变及与超敏感性.在碱基置换突变检测体系下,recA重组途径缺陷菌株的"增变因子"(mutator)效应并不明显.成功构建与转化了大肠杆菌pET28a(+)-mutS(DE)表达构建子,经诱导突变MutS表达后,以利福平抗性突变为检测指标,pET28a(+)-mutS(DE)转化子表达的突变蛋白质在活细胞体内具有很强"增变"作用.作为一种mutator,可以尝试在工业菌株应用此类构建子来提高工业菌株的突变率.
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