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茶氨酸是茶树体内特有的氨基酸,不仅是茶的主要呈味物质,也是其主要功能成分,可以改善人体免疫功能,提高抵抗力等。茶氨酸合成酶(TS)和谷氨酰胺合成酶(GS)是茶氨酸代谢途径中的两个关键酶。谷氨酰胺合成酶广泛存在于原核与真核生物体内,是参与高等植物体内氨同化过程的关键酶;茶树根部以GS/GOGAT为主要途径,利用无机氮合成谷氨酸及其酰胺。提高谷氨酰胺合成酶的活性,有利于茶树体内茶氨酸的合成。茶氨酸合成酶直接参与了茶树体内的茶氨酸合成,前人虽已从茶鲜叶中分离出茶氨酸合成酶,并进行了初步的酶学特性研究,由于其极不稳定,难以进一步分离纯化,相关研究一直停滞不前。
本文对茶树的TS和GS基因进行了体外表达,纯化获得目的蛋白后通过免疫家兔制备获得抗体,利用免疫印迹杂交技术从蛋白水平上检测盐胁迫和遮荫处理条件下茶苗根和新梢中TS、GS的表达差异;采用HPLC方法检测了样品中游离氨基酸的含量,探讨NaCl处理和遮荫处理对茶树体内TS、GS的表达以及对游离氨基酸代谢的影响。论文取得以下主要结果:
1.茶树TS和GS基因导入表达质粒pEASYTS、pEASYGS,并转入大肠杆菌Reastta Good中,经异丙基βD硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导大量表达,分析诱导前后SDSPAGE胶,发现诱导后包涵体蛋白约在40 kDa处出现目的条带,与预期结果相符,经NiNTA亲和层析柱纯化获得目的蛋白,免疫家兔获得抗血清,免疫印迹结果表明重组茶树的TS、GS具有良好的免疫原。
2.以盐处理及遮荫处理后茶籽苗的茎叶和根部为试验材料制备粗蛋白提取液,经过SDSPAGE后转膜,采用Western blot和ECL显色,检测TS、GS在样品中的表达情况。结果显示,低浓度NaCl处理和适当的遮荫处理可以提高茶树中TS、GS的表达量;HPLC检测样品中的游离氨基酸尤其是茶氨酸及谷氨酰胺的含量,结果表明,遮荫及盐胁迫处理后,茶树体内茶氨酸等游离氨基酸的含量明显增加。说明遮荫及盐处理有利于茶树体内茶氨酸等游离氨基酸的积累,能提高茶叶的品质。