基于智能手机检测肉制品中兽药多残留免疫芯片分析方法的研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:halicarnasus
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“民以食为天,食以安为先”,食品安全问题是社会所关注的焦点问题之一。目前养殖业者为了追求利益的最大化,常常违规使用禁用药物,且超范围、超量使用兽药现象十分严重,兽药残留导致的中毒事件时有发生。国家对食品安全愈加重视,在农业部印发的《2017年动物及动物产品兽药残留监控计划》中肉制品需要检测的兽药残留指标多达三十类,某些兽药残留的限量要求低至0.2μg/kg。对于食品安全残留检测的结果准确度、检测时间等成为当下公众最关心的问题。目前,检测肉制品中兽药残留的方法主要有HPLC-MS等仪器确证方法和ELISA等传统免疫快速检测分析方法,但这些检测方法存在需要借助专业的仪器设备,操作繁琐,检测通量低、不能达到现场快速筛查检测的目的等问题,因此极有必要开发快速简便有效且成本低的用于检测兽药多残留的方法。智能手机与人们的生活密切相关,普及范围非常广。它具有高速的分析处理和高清的图像采集能力,结合其具有开放的操作系统,易于开发,同时操作灵活,携带方便,在食品安全现场快速检测方面展现出巨大的潜力。本文以莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺四种肉制品中重要的兽药残留为研究对象,建立了四种兽药残留同时检测的免疫芯片分析方法,开发了与之配套的智能手机检测APP,样品经过免疫芯片检测后可直接在手机端显示出样品中每种兽药残留的含量,真正实现了对兽药多残留简便且低成本的快速检测。本论文的主要研究内容如下:(1)以硝酸纤维素膜为固相载体,采用ic-ELISA的反应原理,分别建立莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的免疫芯片分析方法,分别确定莱克多巴胺检测抗原的点阵浓度为20μg/mL,抗体浓度为0.22μg/mL,并确定其灵敏度为2 ng/mL;确定β2-兴奋剂检测抗原的点阵浓度为25μg/mL,抗体浓度为0.15μg/mL,并确定其灵敏度为2 ng/mL;确定氯霉素检测抗原的点阵浓度为3.2μg/mL,抗体浓度为0.022μg/mL,并确定其灵敏度为0.5 ng/mL;确定氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺检测抗原的点阵浓度为10μg/mL,抗体浓度为0.025μg/mL,并确定其灵敏度为50 ng/mL。(2)在建立单独检测一种兽药残留免疫芯片分析方法的基础上,建立同时检测莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺四种兽药残留免疫芯片的分析方法。对影响免疫芯片分析的因素进行优化,结果表明,选用0.22μm的硝酸纤维素膜;碳酸盐缓冲液作为莱克多巴胺和氯霉素用的点样液,磷酸盐缓冲液作为β2-兴奋剂和氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺用的点样液时有利于包被原的固化;最优包被方式为37℃恒温水浴包被;最优反应时间为包被1 h,封闭30 min,一抗孵育15 min,二抗孵育15 min,最优抗体稀释液是T液;最佳洗涤次数是4次;对四种兽药残留的抗原-抗体-药物特异性进行评价,无明显交叉反应。同时用Photoshop软件读取显色结果的灰度值,建立四种兽药残留的数字比色检测方法。四种兽药残留的线性范围依次为0.252 ng/mL、0.252 ng/mL、0.06250.5 ng/mL和6.2550 ng/mL;线性方程依次为y=-3.12x+3.18、y=-2.92x+3.335、y=-6.88x+2.265和y=-0.0352x+1.63;猪尿样品批内、批间回收率分别为70.4%138.67%、70.02%137.60%,变异系数分别为3.81%33.4%、4.54%31.2%。四种兽药残留的回收率变异系数均小于35%,该方法具有较好的准确性。(3)用实验室开发出来的智能手机APP软件及配套的图片采集装置建立基于智能手机的免疫芯片分析方法,实现四种兽药残留同时快速定量检测。基于智能手机的免疫芯片分析方法检测莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在猪尿样品中添加回收率为76.56%139.88%,变异系数小于30%。与胶体金检测卡相比,免疫芯片定性判断准确性较高,免疫芯片定性判断准确性为100%,胶体金定性判断准确性为98.75%。同ELISA试剂盒检测结果相比,线性系数依次为y=0.9295x+0.035、y=0.8792x+0.0518、y=1.1115x-0.012和y=0.784x+2.2432,相关系数依次为R2=0.9476、R2=0.9194、R2=0.9495和R2=0.935,说明该方法具有良好的一致性与可靠性。
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