论文部分内容阅读
儿茶素(Tea catechia,TC)是从茶叶中提取的多酚化合物,它在体内外均有抗氧化功能,能够清除体内过多的自由基。本研究的目的是基于山羊基因和细胞水平探讨TC对山羊抗氧化系统关键酶活性和基因表达量以及自由基的影响,同时在体外研究TC对原代培养的山羊抗氧化应激/应激肝细胞模型中抗氧化系统的调控机制。
采用随机区组试验设计,选择健康的生长期山羊40只,随机分为4组,每组10只。通过向生长期山羊日粮中添加0、2000、3000和4000 mg TC/kg feed,饲喂60天后屠宰取样分析,研究不同水平TC对山羊血浆和组织中抗氧化酶活性、抑制自由基能力以及其它参数影响。结果表明:随着日粮TC水平的增加,血浆TAC、MDA和GSH含量呈线性下降(P<0.001),而且存在时间效应,饲喂时间小于40天时MDA含量都呈下降趋势；日粮中不同水平TC降低血浆GSH含量,但是添加40天后又显著提高GSH含量(P<0.001)；日粮中添加不同水平TC显著增加血浆中T-SOD(P<0.001)、Cat(P=0.001)和XOD(P<0.001)活性,降低血浆GPx活性(P<0.001)活性,对血浆GR、GST和T-NOS活性均没有显著影响。TC对抗氧化酶活性影响存在时间剂量效应；日粮添加TC显著降低血浆H2O2水平(P<0.001)和血浆O2-抑制活性(P=0.025),提高血浆NO浓度(P=0.024),对血浆OH抑制活性没有显著影响。日粮中添加不同水平TC对血浆自由基的影响存在时间效应,随着饲喂时间的延长,血浆H2O2水平和对自由基的抑制能力均呈线性下降(P<0.001);随着日粮TC水平增加,肝脏中T-SOD(P=0.007)和GPx(P=0.01)活性呈二次方下降,GST的活性显著降低(P<0.05),肝脏中Cat和GR的活性不受日粮中TC添加水平的影响；随着日粮TC水平增加,心脏中Cat的活性呈线性下降(P<0.001),而心脏中其它酶活性不受影响,肾脏中GPx(P<0.001)和Cat(P<0.001)的活性呈线性下降,背最长肌中Cat的活性呈线性下降(P<0.001),大脑中GR活性呈线性增加(P=0.012),Cat活性呈线性降低(P=0.001)。
山羊抗氧化酶基因中仍有一些是未知序列基因,这限制了关于基因表达调控的深入研究。本试验通过同源比对与保守序列分析设计引物,通过RT-PCR克隆得到了山羊Cat、MnSOD和GPx1基因的部分CDS序列,并提交GeneBank注册,注册号分别为GQ204786、GQ204787和GQ292760,并利用网络数据库和生物信息学工具软件,对新克隆基因进行了核酸序列和氨基酸序列分析；采用Real time-PCR的方法研究了基于山羊基因水平上TC的抗氧化机制。结果表明,随着日粮TC水平的增加,肝脏中CuZn-SODmRNA表达量呈二次方下降(P=0.031),肝脏中ECSOD mRNA表达量呈线性升高(P=0.002),肾脏中CuZn-SOD mRNA表达量呈二次方下降(P=0.002),瘤胃上皮中CuZn-SODmRNlA表达量呈三次方升高(P=0.04),ECSODmRNA表达量呈二次方升高(P<0.001),胰腺中CuZn-SOD(P=0.008)和ECSOD(P=0.019)mRNA表达量呈线性升高。
采用“胶原酶两步灌注法”分离山羊肝细胞,完善了山羊肝细胞原代培养体系。为了研究TC对山羊肝细胞抗氧化系统中抗氧化酶的调控机理,本试验建立了抗氧化应激肝细胞模型,分别用5和50μg/ml浓度的TC提前孵育肝细胞进行抗氧化保护处理,分别在培养24、48、72和96 h后收集细胞分析,在每次收集细胞前3 h分别用0.1和1 mMH2O2诱导细胞氧化应激。结果表明:H2O2诱导氧化应激对肝细胞增殖没有显著影响。高浓度TC极显著提高正常肝细胞增殖(P<0.001),而且对H2O2诱导应激引起的细胞增殖下降有抑制作用,且存在剂量效应,高浓度抑制效果显著(P<0.001)；诱导应激和TC抗氧化处理对肝细胞T-SOD和Cat的活性均没有显著影响,但培养时间对其活性影响显著,培养48 h时T-SOD(P<0.001)和Cat(P=0.008)的活性最高；TC对正常肝细胞GPx活性没有影响,在高浓度H2O2诱导应激条件下,低剂量TC显著提高GPx活性(P<0.001);TC抗氧化处理和诱导氧化应激对肝细胞MDA、H2O2浓度、OH和O2-抑制活性均没有显著影响,但培养时间对以上指标影响显著(P<0.001),短时间培养能提高细胞自由基抑制活性；TC孵育和H2O2诱导氧化应激对肝细胞中的部分抗氧化酶mRNA表达量存在极显著影响(P<0.001),在没有氧化应激的条件下,TC可以提高CuZn-SOD、MnSOD、ECSOD、Cat、GPx、FAS和:PPARα mRNA表达量,如果细胞处于应激条件下,只有低浓度TC能提高相应抗氧化酶mRNA表达量。
综合研究结果表明:山羊日粮添加2000mg/kg的TC,饲喂40天以内,有助于维持机体抗氧化系统稳衡。对于体外培养的肝细胞,H2O2诱导应激引起抗氧化酶mRNA表达受到抑制或降低,而5μg/ml TC可以保护细胞免受应激的影响,提高其mRNA表达量。TC在mRNA表达水平上影响细胞抗氧化酶,而对其活性没有显著影响。