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栀子是一味重要的中药材,又名山栀子,是茜草科植物山栀的果实,其中栀子果实的主要有效成分为山栀苷、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷等环烯醚萜苷类化合物。栀子和淡豆豉是传统中药配伍中的一对经典药对,广泛应用于临床研究中。其中,淡豆豉的主要活性成分为异黄酮。异黄酮是一种结构与雌激素相似的生物活性化合物,被称为植物雌激素。课题组前期研究饮食中的异黄酮对淡豆豉体内药代动力学的影响时发现异黄酮可能通过调控肠道菌上调β-葡萄糖苷酶的活性从而促进糖苷向苷元的脱糖代谢。由于栀子中环烯醚萜苷的体内代谢过程也受β-葡萄糖苷酶的调控,所以本文通过大鼠灌胃不同时间的异黄酮,研究了异黄酮对栀子中环烯醚萜苷成分药代动力学特征的影响。为了分析栀子中主要环烯醚萜苷,首先建立了栀子环烯醚萜苷有效部位中山栀苷、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷三种环烯醚萜苷成分的定性定量分析方法。接着建立了大鼠口服栀子环烯醚萜苷有效部位提取物后血浆中的山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷和代谢产物京尼平的定性定量分析方法。随着异黄酮暴露时间的增加,研究肠道菌介导的肠代谢受影响的程度,并通过比较四种物质在异黄酮暴露不同时间的大鼠体内的药代动力学行为,研究了异黄酮对环烯醚萜苷在大鼠体内药代动力学的影响。本课题开展了以下五个方面的研究:一、栀子环烯醚萜苷有效部位中三种环烯醚萜苷的定量分析本研究建立了一种同时测定栀子环烯醚萜苷有效部位中三种环烯醚萜成分含量的LC-MS/MS法。该方法具有良好的选择性、灵敏度、精密度,证明该方法适用于栀子环烯醚萜苷有效部位中三种环烯醚萜苷的定量分析研究。色谱条件为反向C18柱（100 mm×4.6 mm,5μm）,使用梯度洗脱,流动相为0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈（B）,流速为0.4 ml/min,分析时间5 min;质谱条件为电喷雾离子化电离源,正离子（京尼平龙胆双糖苷）和负离子（山栀苷和栀子苷）切换模式下进行多反应监测。样品符合线性关系（R>0.999）,并且精密度、准确度、加样回收率、重复性和稳定性试验结果均符合要求。并且运用此方法,同时检测了栀子环烯醚萜苷有效部位中三种环烯醚萜苷成分的含量。二、栀子中三种环烯醚萜苷及其代谢产物在大鼠血浆中分析方法的建立与确证本研究建立了一种同时测定正常大鼠和不同时间异黄酮暴露大鼠口服栀子环烯醚萜苷有效部位提取物后血浆中三种环烯醚萜苷及其代谢产物含量的LC-MS/MS法。经过方法学验证,其专属性、线性关系、精确度、准确度、稳定性等均符合要求。大鼠血浆采用固相萃取法进行前处理,以芍药苷作为内标物。色谱分析条件为Waters T3柱（150 mm×4.6 mm,3μm）,流动相为0.06%乙酸水（A）-0.06%乙酸乙腈（B）,梯度洗脱,流速为0.6 ml/min,分析时间为19 min;电喷雾离子源,正离子（京尼平龙胆双糖苷）和负离子（山栀苷、栀子苷、京尼平和IS）切换模式下进行多反应监测。经过方法学验证发现,样品符合线性关系（R>0.99）,日内和日间精密度（RSD）均小于12.2%,准确度（RE）在-10.1%16.4%之间,基质效应在81.289.2%范围内,固相萃取提取回收率均大于53.8%。所以该方法可以用于大鼠血浆中环烯醚萜苷药代动力学研究的测定。三、栀子中三种环烯醚萜苷及其代谢产物在正常SD大鼠的体内药代动力学研究利用如上建立的LC-MS/MS定性定量分析方法测定了正常大鼠单次口服给药栀子环烯醚萜苷有效部位提取物后体内山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷和京尼平的血药浓度,计算四种物质的药代动力学参数(Cmax、t1/2、Tmax、MRT、AUC0→t和AUC0→∞),绘制四种物质的药时曲线图,评价正常大鼠体内栀子中环烯醚萜苷的药代动力学行为。四、栀子中三种环烯醚萜苷及其代谢产物在不同时间的异黄酮暴露大鼠的体内药代动力学研究本实验将正常SD大鼠平均分为4组,分别口服异黄酮提取物7天、14天、21天和28天后,单次口服给药栀子环烯醚萜苷有效部位提取物后,利用所建立的LC-MS/MS定性定量分析方法测定了4组经异黄酮暴露大鼠单次口服给药栀子环烯醚萜苷有效部位提取物后体内山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷和京尼平的血药浓度,计算四种物质的药代动力学参数(Cmax、t1/2、Tmax、MRT、AUC0→t和AUC0→∞),绘制四种物质的药时曲线图,评价不同时间异黄酮处理大鼠体内栀子中环烯醚萜苷的药代动力学行为。五、异黄酮对栀子中环烯醚萜苷药代动力特征影响的研究通过比较正常大鼠和不同异黄酮暴露时间的大鼠发现,随着异黄酮在大鼠体内暴露的时间增加,山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷及其代谢产物京尼平的药代动力学参数也在逐渐改变,并且其Ⅱ相代谢物京尼平硫酸盐结合物也在在逐渐改变。这就提示,随着异黄酮暴露时间的增加,肠道菌群可能发生变化,同时肠道菌调控的代谢酶活性可能也在发生变化。所以,当临床上共同服用异黄酮和环烯醚萜苷时,不仅需要考虑药物之间的相互作用,还需要考虑药物对肠道菌介导的代谢的影响。