论文部分内容阅读
目的:胶质细胞系源性神经营养因子(glia cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)能有效地保护中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经细胞。已知,GDNF发挥对DA能神经细胞特异性保护作用时,激活的胞内信号通路主要为PI3K/AKT。我们的前期实验已初步证实干扰N-cadherin表达后,GDNF对DA能神经细胞的保护作用受到影响,提示N-cadherin能够介导GDNF保护DA能神经细胞作用。因而,我们提出GDNF是否也能够通过N-cadherin来激活PI3K/AKT信号通路?
方法:首先,用基因沉默的方法干扰N-cadherin的表达,将MN9D细胞分为四组:空白对照组、空脂质体组、空质粒组和质粒转染组,用western blot方法检测phospho-N-cadherin(Tyr860)和phospho-Akt(Ser473)细胞的含量。其次,通过不同剂量的GDNF作用相同时间,将成年SD大鼠各分为六组:PBS组、空白对照、25ng剂量组、50ng剂量组、75ng剂量组和100ng剂量组;干扰后的MN9D细胞分为六组:BSA作用组、空白对照、25ng/ml剂量组、50ng/ml剂量组、75ng/ml剂量组和100ng/ml剂量组。根据相同剂量GDNF作用的不同时间,将SD大鼠分为七组:PBS作用组、空白对照、15min作用组、30min作用组、45min作用组、60min作用组和2h作用组;干扰后的MN9D细胞分为六组:BSA组、空白对照、5min作用组,15min作用组、30min作用组、45min作用组;用western blot检测phospho-N-cadherin(Tyr860)和phospho-Akt(Ser473)细胞的含量。最后,将MN9D细胞分为四组:质粒转染+GDNF组、质粒转染组、GDNF组、空白对照。用细胞免疫化学的办法来检测phospho-N-cadherin(Tyr860)、N-cadherin、phospho-Akt(Ser473)和Akt在细胞中的含量。
结果:首先,western blot结果显示,随着GDNF作用时间和剂量的变化,phospho-N-cadherin(Tyr860)和N-cadherin(a.a.853-864)细胞的含量也相应变化,提示GDNF能够使N-cadherin的Tyr860位点磷酸化。其次,干扰了N-cadherin表达后,western blot结果显示Phospho-N-cadherin(Tyr860)和Phospho-Akt(Ser473)细胞的含量均降低。此外,免疫细胞化学的结果也显示Phospho-N-cadherin(Tyr860)和Phospho-Akt(Ser473)细胞的含量均降低;总N-cadherin细胞的含量也降低而总Akt细胞的含量不变。最后,在GDNF作用下,western blot结果显示,剂量曲线中Phospho-N-cadherin(Tyr860)和Phospho-Akt(Ser473)细胞的含量均在GDNF50ng组(in vivo& in vitro)最高;时间曲线中均在GDNF作用时间为15min组(in vitro)和30min组(in vivo)最高。此外,Phospho-N-cadherin(Tyr860)和Phospho-Akt(Ser473)细胞的含量之间存在正相关。
结论: N-cadherin能够作为GDNF的信号转导受体,并且能激活PI3K/AKT信号通路来介导GDNF对DA能神经细胞的保护作用。