【摘 要】
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目的:探讨瞬时受体电位离子通道TRPM7(Transient Receptor Potential Melastatin 7)在人口腔颊黏膜成纤维细胞中是否表达,以及抑制TRPM7离子通道后对人口腔颊黏膜成纤维细胞增殖和迁移的影响。方法:本实验所采用的组织来源于西南医科大学附属医院口腔颌面外科手术室,采用组织块法体外培养人口腔颊黏膜成纤维细胞。1.分离纯化后经免疫荧光染色鉴定是否为成纤维细胞;2.
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目的:探讨瞬时受体电位离子通道TRPM7（Transient Receptor Potential Melastatin 7）在人口腔颊黏膜成纤维细胞中是否表达,以及抑制TRPM7离子通道后对人口腔颊黏膜成纤维细胞增殖和迁移的影响。方法:本实验所采用的组织来源于西南医科大学附属医院口腔颌面外科手术室,采用组织块法体外培养人口腔颊黏膜成纤维细胞。1.分离纯化后经免疫荧光染色鉴定是否为成纤维细胞;2.接着采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫荧光法检测人口腔颊黏膜成纤维细胞中TRPM7离子通道的表达,全细胞膜片钳技术记录人口腔颊黏膜成纤维细胞TRPM7离子通道的全细胞电流;3.将培养的细胞设置为3组:对照组、TRPM7shRNA组和2-APB组。对照组为正常培养的人口腔颊黏膜成纤维细胞,不做特殊处理。TRPM7 shRNA组应用TRPM7 shRNA病毒转染人口腔颊黏膜成纤维细胞,48 h后倒置荧光显微镜下观察转染效果,再次采用RT-PCR检测TRPM7离子通道的表达,验证TRPM7离子通道是否抑制成功,采用全细胞膜片钳记录TRPM7 shRNA组人口腔颊黏膜成纤维细胞的全细胞电流变化。2-APB组应用500μmol/L 2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB）作用于人口腔颊黏膜成纤维细胞抑制TRPM7离子通道的表达,48 h后采用全细胞膜片钳记录2-APB组人口腔颊黏膜成纤维细胞的全细胞电流变化;4.TRPM7 shRNA组、2-APB组成功抑制TRPM7离子通道后,与对照组继续培养24 h,采用MTT细胞增殖实验和细胞划痕实验分别检测上述3组细胞的增殖能力和迁移能力,并进行比较,研究抑制TRPM7离子通道后对人口腔颊黏膜成纤维细胞增殖和迁移的影响;5.统计学方法:采用SPSS17和GraphPad Prism7软件进行数据统计学分析和柱状图的绘制,以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1.采用组织块法成功培养人口腔颊黏膜成纤维细胞原代,传至第3代经过分离纯化后利用免疫荧光染色鉴定,结果符合成纤维细胞的生物学特征,证实培养的细胞为人口腔颊黏膜成纤维细胞;2.利用RT-PCR法和免疫荧光法证实人口腔颊黏膜成纤维细胞功能性表达TRPM7离子通道,全细胞膜片钳技术记录到典型的TRPM7离子通道全细胞电流;3.TRPM7 shRNA作用48 h后成功转染人口腔颊黏膜成纤维细胞,倒置荧光显微镜下可见细胞发出特异性绿色荧光,RT-PCR结果显示TRPM7shRNA组细胞TRPM7离子通道无表达,全细胞膜片钳实验结果表明,TRPM7 shRNA组人口腔颊黏膜成纤维细胞的TRPM7离子通道全细胞电流明显减弱。500μmol/L 2-APB作用于人口腔颊黏膜成纤维细胞48 h后,利用膜片钳技术记录2-APB组全细胞电流,在电极内液无Mg2+条件下,记录到典型的TRPM7离子通道全细胞电流被阻断,以上实验结果证明TRPM7 shRNA组和2-APB组在处理48 h后均可成功抑制人口腔颊黏膜细胞TRPM7离子通道的表达;4.采用MTT细胞增殖实验检测3组细胞的增殖能力,结果显示与对照组相比,在第24 h 2-APB组细胞增值率下降约25%,TRPM7 shRNA组细胞增殖率下降约35%,差异均有统计学意义（p<0.05）。采用细胞划痕实验检测3组细胞的迁移能力,结果显示与对照组相比,在第24 h 2-APB组细胞划痕愈合率下降约67%,TRPM7 shRNA组细胞划痕愈合率下降约53%,差异均有统计学意义（p<0.05）。以上结果说明抑制TRPM7离子通道后人口腔颊黏膜纤维细胞的增殖和迁移能力均受到明显抑制。结论:人口腔颊黏膜成纤维细胞功能性表达TRPM7离子通道,并且TRPM7离子通道参与人口腔颊黏膜成纤维细胞增殖以及迁移能力的调控。
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