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研究背景:非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指排除酒精等因素,以脂质沉积为主要特征的一组肝脏获得性代谢性疾病,包括单纯性肝脂肪变性（Nonalcoholic simple fatty liver,NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）、可发展为肝纤维化,甚至肝硬化和肝细胞癌。NAFLD是世界范围内流行的慢性肝病,具有大流行趋势、病程漫长、预后不良、多并发症和可造成巨大经济负担的特殊性质,已成为严重的公共卫生问题。NAFLD作为慢性肝病的危险因素多种多样,尽管NAFLD的确切病因尚不清楚,但新兴的实验和流行病学研究表明,环境内分泌干扰物质（Endocrine disrupting chemicals,EDCs）的暴露可能促进NAFLD的发病率增高。壬基酚（Nonylphenol,NP）是一种典型的EDCs,在环境中广泛存在。目前NP的研究多集中于对动物体内生殖系统、神经系统、免疫系统和内分泌系统的健康影响,而NP与肝脏代谢系统的相关研究较少,造成肝脏损伤的情况尚不清楚。已有研究表明NP暴露可能造成鱼类和鼠类的肝脂肪变性,但NP在其中发挥的具体分子机制作用尚不明确。本文将以HepG2细胞建立体外培养模型,观测NP暴露可致肝脂肪变性,从而诱导NAFLD样改变的作用及机制。姜黄素（Curcumin,CUR）是一种具有高度生物活性的多酚类物质,广泛用作食品添加剂。近年来作为膳食补充剂,因其自身的抗炎、抗氧化、调节脂质代谢的特性,在预防和治疗NAFLD的发生发展中起到重要的作用。本文将在研究NP致HepG2细胞脂肪变性的基础上,探讨姜黄素对此的改善作用及相关机制。研究目的:通过建立NP诱导HepG2细胞脂肪变性模型,以NP导致HepG2细胞脂质代谢紊乱为切入点,从ROS、AMPK/m TOR信号通路、脂质生成、脂肪酸氧化的角度探讨姜黄素对NP诱导HepG2细胞脂肪变性的改善作用及机制。研究方法:将HepG2细胞置于设定为37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养,同时使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM basic（1×）完全培养基给予HepG2细胞生长所需营养,根据细胞生长增殖情况进行换液或传代,或开展后续实验。本研究将观测NP的一般毒性效应,及其对脂滴（Lipid droplets,LDs）积聚、甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（Total cholesterol,T-CHO）含量、脂质代谢过程中关键基因、活性氧（Reactive oxidative species,ROS）水平和AMPK/m TOR信号通路的影响。然后使用姜黄素进行干预,并从细胞和分子水平系统的探讨姜黄素对NP诱导HepG2细胞脂肪变性的改善作用及其机制。1.NP暴露影响脂质代谢致HepG2细胞脂肪变性使用0-100μM NP培养液孵育HepG2细胞24 h,通过CCK-8细胞增殖实验观察NP对HepG2细胞活力的影响,选择适宜的浓度建立脂肪变性细胞模型;使用尼罗红荧光染色实验观察胞内脂滴积聚情况,用相应试剂盒检测HepG2细胞内TG、T-CHO含量,从而测定NP对HepG2细胞脂肪变性的影响;通过实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,q PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测脂质生成相关关键基因乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、甾醇调节元件结合蛋白-1c（Srebp-1c）、CAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（SCD-1）和脂肪酸氧化相关关键基因肉碱棕榈糖基转移酶1α（CPT1α）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）的m RNA水平和蛋白水平的表达情况。探讨NP暴露致HepG2细胞脂肪变性中脂质代谢的作用。2.NP通过ROS致HepG2细胞脂肪变性的机制研究使用20、30、40μM NP培养液孵育HepG2细胞24 h,通过流式细胞术检测ROS变化,观察NP致HepG2细胞脂肪变性中氧化应激的作用;使用10 m M的N-乙酰基-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）预孵2 h抑制ROS活性,随后用40μM NP继续培养24 h,观察胞内脂滴积聚情况,TG、T-CHO含量,脂质生成与脂肪酸氧化相关关键基因蛋白水平以及ROS水平;最后通过Western blot测定NP暴露及NAC处理中AMPK信号通路的p-AMPK、AMPK、p-m TOR、m TOR相关蛋白水平的表达。系统地阐明NP影响氧化应激、AMPK/m TOR信号通路、脂质代谢致NAFLD样改变的作用及机制。3.姜黄素干预对NP诱导HepG2细胞脂肪变性的改善作用及机制研究根据实验目的,使用0-60μM姜黄素与40μM NP共同培养HepG2细胞24 h,通过CCK-8细胞增殖实验观察姜黄素对HepG2细胞活力的影响,选择5、10、20μM浓度进行后续实验;观察胞内脂滴积聚情况,TG、T-CHO含量,脂质生成与脂肪酸氧化相关关键基因蛋白水平,ROS水平,AMPK/m TOR信号通路相关蛋白水平的表达。从细胞和分子水平研究姜黄素干预对NP诱导HepG2细胞脂肪变性的保护作用及机制。研究结果:1.建立NP诱导HepG2细胞脂肪变性模型CCK-8实验结果显示,在10-40μM浓度处NP不会显著影响HepG2的细胞活力（P＞0.05）,而在超过40μM浓度处理下的NP呈剂量依赖式的显著降低HepG2的细胞活力（P＜0.001）。进而用20μM、30μM、40μM NP处理HepG2细胞24 h,与对照组相比,NP暴露组的HepG2细胞均发生尼罗红荧光强度增强和脂滴积聚,TG、T-CHO表达水平显著提高（P＜0.001）。以上结果表明,本研究建立了NP诱导立HepG2细胞脂肪变性模型。2.NP诱导HepG2细胞脂质代谢紊乱实时荧光定量PCR检测脂质生成相关关键基因ACC、FAS、Srebp-1c、C/EBPα、PPARγ和脂肪酸氧化相关关键基因CPT1α、PPARα的结果表明,与对照组相比,NP暴露后显著增加脂质生成关键基因m RNA的表达水平（P＜0.05）;显著减少脂肪酸氧化关键基因m RNA的表达水平（P＜0.01）。进一步通过Western blot检测相应蛋白的表达水平进行验证,结果显示与m RNA水平的表达相一致。这些结果提示,NP能引起HepG2细胞发生脂质代谢紊乱。3.NP诱导HepG2细胞氧化应激反应通过流式细胞术检测ROS的水平来判断氧化应激的程度。结果显示,NP处理后的HepG2细胞中ROS含量与对照组相比显著升高（P＜0.001）,提示NP能激活HepG2细胞的氧化应激反应。4.NP抑制HepG2细胞的AMPK/m TOR信号通路Western blot结果显示,与对照组相比,随着NP处理浓度的增加,p-AMPK/AMPK的比值明显降低,p-m TOR/m TOR的比值明显升高（P＜0.01）,说明NP可抑制HepG2细胞中AMPK/m TOR信号通路的表达。5.NP通过ROS介导的AMPK/m TOR信号通路诱导HepG2细胞脂肪变性使用NAC（ROS清除剂）进一步探究ROS在NP致HepG2细胞脂肪变性中的作用效应。结果显示,与NP单独处理组相比,NP+NAC联合处理组显著抑制了HepG2细胞内ROS水平的表达（P＜0.001）;NAC预处理后显著减少了脂滴的数量和形状大小,并显著降低了HepG2细胞中TG、T-CHO水平的表达（P＜0.05）。这些结果表明了ROS可能是NP引起HepG2细胞脂肪变性重要因素之一。进而从脂质代谢角度,阐明ROS在NP致HepG2细胞脂肪变性中的作用机制。Western blot检测结果表明,NP+NAC联合处理组的HepG2细胞中ACC、FAS、Srebp-1c、C/EBPα、PPARγ、SCD-1及CPT1α、PPARα脂质代谢相关关键基因的蛋白表达水平被显著逆转（P＜0.01）。这些结果表明,ROS可能通过调节脂质代谢途径,在NP引起的HepG2细胞脂肪变性中发挥作用。根据上述实验结果,进一步研究NP是否通过ROS影响AMPK/m TOR信号通路,从而在诱导HepG2细胞脂肪变性中发挥作用。Western blot实验结果表明,NP+NAC联合处理后的p-AMPK/AMPK的比值与NP单独处理相比明显升高,而p-m TOR/m TOR的比值明显降低（P＜0.05）。上述结果表明,NP可能通过氧化应激作用,抑制了AMPK/m TOR信号通路,从而诱导了HepG2细胞发生NAFLD样改变。此外,因为AMPK信号是脂质代谢途径的上游调节因素之一,所以本研究中,NP暴露可能通过ROS经由AMPK/m TOR信号通路,调节下游脂质生成和脂肪酸氧化相关基因ACC、FAS、Srebp-1c、C/EBPα、PPARγ、SCD-1、CPT1α、PPARα的表达,在HepG2细胞脂肪变性中发挥作用。6.姜黄素改善NP诱导的HepG2细胞脂肪变性CCK-8实验结果显示,5-20μM姜黄素联合40μM NP对HepG2细胞活力无明显的影响（P＞0.05）。进一步用5μM、10μM、20μM浓度的姜黄素联合40μM NP共同孵育HepG2细胞24 h,结果显示,姜黄素改善NP所致的HepG2细胞脂质积聚、TG和T-CHO含量增加（P＜0.001）。因此,姜黄素改善了NP诱导HepG2细胞脂肪变性。7.姜黄素改善NP诱导的HepG2细胞脂质代谢紊乱实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,NP诱导的脂质代谢紊乱中脂质生成相关关键基因的m RNA和蛋白表达升高,和脂肪酸氧化相关关键基因的m RNA和蛋白表达减少,均被姜黄素显著逆转（P＜0.01）。因此,姜黄素可改善NP诱导的HepG2细胞脂质代谢紊乱,从而减轻HepG2细胞脂肪变性的严重性。8.姜黄素改善NP诱导的HepG2细胞氧化应激反应流式细胞术检测结果显示,姜黄素干预后胞内ROS含量显著降低（P＜0.01）,说明姜黄素干预后可改善NP诱导HepG2细胞的氧化应激反应。9.姜黄素激活NP抑制的AMPK/m TOR信号通路Western blot结果表明,与NP单独处理相比,姜黄素共同处理后p-AMPK/AMPK的比值显著上调,而p-m TOR/m TOR的比值显著下调（P＜0.01）。因此,姜黄素可激活NP抑制的AMPK/m TOR信号通路,改善肝脂肪变性,对NAFLD样改变发挥保护作用。研究结论:NP暴露可诱导HepG2细胞脂肪变性,与NP上调脂质生成、下调脂肪酸氧化、激活ROS、抑制AMPK/m TOR信号通路等作用机制密切相关;姜黄素可通过降低ROS、激活AMPK/m TOR信号通路逆转脂质代谢紊乱,从而抑制NP诱导的HepG2细胞脂肪变性,改善NAFLD样改变。本文研究可为明确NP与NAFLD的关系提供新的理论依据,并为姜黄素防治NAFLD的应用提供新的理论支持。