牙龈卟啉单细胞菌凝血素2基因缺陷菌株的构建

• 作 者: 林梅
• 机 构: 首都医科大学
• 出 处: 首都医科大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 牙龈卟啉单胞菌 凝血素 基因敲除 牙周致病菌 牙周炎

牙龈卟啉单胞菌(P.g)是革兰氏阴性、专性厌氧、产黑色素类杆菌，是国际公认的主要牙周致病菌，其龈下定植与牙周炎的发生和发展密切相关。作为绝对需铁菌，P．g-不能产生铁载体。所以在人体中P．g主要利用外源性的铁/亚铁血红素，通过特异性外膜受体结合含铁蛋白中的铁/亚铁血红素，并将其转运至细胞内。铁/亚铁血红素对于P．g的生长和毒性都起着重要作用。
P.g含有多种毒性因子，如蛋白酶菌毛、凝血素、脂多糖等，其中蛋白酶和凝血素是P．g两种主要的毒力因子。Gingipains暂称半胱氨酸蛋白酶或胰酶样蛋白酶(TLP)，被认为是P.g一种重要的毒性因子。Gingipains主要有两种：一种是精氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(Rgp)，另一种是赖氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(Kgp)。Rgp以RgpA和RgpB两种形式存在，二者的差异在于RgpB缺乏红细胞凝集/黏附结构域。RgpA和：Kgp的红细胞凝集/黏附结构域由HA1、HA2、HA3和HA4四部分组成，二者的HA2基因序列完全相同。HA2基因序列与凝血素}{agA上的重复区H_Arep基因序列具有高度同源性。
最新的研究表明HA2特异且直接地与血红蛋白中血红素的卟啉环结合，二者之间具有高度的亲和力，目的是获得P.g生存所必需的营养物质铁和卟啉，同时聚集在P.g菌体表面的亚铁血红素还能够结合氧及其毒性衍生物，由此可在局部形成一个厌氧环境并形成一个对抗氧的屏障，从而抑制或降低氧对P.g的损害。
目的：构建P.g HA2基因缺陷株，为进一步研究HA2的致病机制做准备。
方法：提取P.g3277基因组DNA，以敏感特异引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增P.g HA2基因上游500bp及下游1000bp作为HA2上臂片段HA<,u>和下臂片段HA<,1>。将它们与抗药基因ermF-ermAM连接，构建打靶载体HA-ermF-ermAM，电转化到P.g ATCC33277中，通过同源重组的方法整合进入P.g ATCC33277染色体。用选择性培养基筛选击中的细胞获得P.gHA2基因缺陷型突变体。
结果：PCR、酶切鉴定并测序，结果表明成功构建打靶载体HA-ermF-ermAM。将打靶载体电转化P.g ATCC33277中，克林霉素5ug/ml筛选转化株，经PCR鉴定，打靶载体HA-ermF-ermAM通过同源重组整合进入P.gATCC33277染色体，成功获得P.g ATCC33277 HA2基因缺陷型突变体。
结论：成功获得P.g HA2基因缺陷型突变体，为进一步研究HA2的生物学性质及免疫学特性奠定了基础。