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研究背景及目的：
现今恶性肿瘤的发病率与死亡率呈逐年上升趋势,结肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,化疗在其治疗手段中占有重要地位。由于药物的不规范使用、肿瘤细胞基因的不稳定性、表达的异质性、高突变率以及不同个体对不同化疗方案的敏感性具有很大差异等因为,很多患者疗效不佳,肿瘤细胞普遍存在多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象。肿瘤细胞对抗肿瘤药物的多药耐药一直是多种恶性肿瘤化疗失败的主要因为。细胞耐药既是细胞维持自身稳定的防御机制之一,也是引起肿瘤化疗失败及肿瘤复发的主要因素。据美国癌症协会估计,每年癌症患者约有49万例死亡,90％以上在不同程度上受耐药影响,其中16％与肿瘤的内源性耐药有关,3％与肿瘤的获得性耐药有关。因此,耐药性的产生是严重影响肿瘤化疗效果的一个瓶颈,是临床化疗急需解决的重要课题。
沉默信息调节因子1(silent information regulator type1,SIRT1)是人类的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs),在各种物种之间呈现高度的保守性,甚至在原核生物中也有其同源基因。SIRT1在人类的七个Ⅲ类去乙酰化酶成员中与酵母沉默信息调节因子2(silence informationregulator2,SIR2)的同源性最高,它们主要通过参与染色质沉默以及能量代谢而调节细胞的衰老过程。人sirt1基因位于10q22.1,长约33 kb,翻译后的蛋白质分子量大小约为60 KD,不存在剪切变异体,具有NAD+依赖的去乙酰基酶活性。它在DNA损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、抵抗氧化逆境和延长细胞寿命方面起着重要作用,因此sirt1被称为“长寿基因”。
研究表明5种临床肿瘤的活检标本和不同细胞来源的耐药细胞,均发现SIRT1的高水平表达。用瞬时转染实验技术证明:在人的293细胞中,SIRT1能直接诱导多药耐药基因1(multidrug resistance1,mdr-1)的表达,导致细胞对药物的敏感性降低。SIRT1是Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶的一种,与Ⅰ型和Ⅱ型HDACs处理后诱导mdr-1基因表达的结果相反,它反而能增加mdr-1基因的表达。使用RNAi特异降低SIRT1表达后,耐药相关基因mdr-1和P-糖蛋白的表达也明显降低,使细胞对药物的敏感性增高。但国内对SIRT1与肿瘤细胞多药耐药之间的关系研究很少,并且SIRT1是否在结肠癌耐药细胞中表达,与结肠癌长春新碱耐药细胞的耐药性是否有关尚未见报道。本课题目的在于探讨SIRT1的表达是否与结肠癌细胞的多药耐药存在着一定的关系,为sirt1基因与细胞交叉耐药相关性的研究提供依据,为逆转肿瘤细胞的多药耐药提供理论基础,最终为治疗结肠癌提供有力的线索。
方法：
本实验采用长春新碱(vincristine,VCR)从低浓度到高浓度逐级递增的作用方法对具有初步耐药性的HCT-8/VCR细胞进行耐药培养,最终获得在一定浓度的VCR培养基中生长良好的耐药细胞系HCT-8/VCR。在用药物冲击细胞的过程中用光镜、倒置相差显微镜观察细胞一般生物学特性的改变。MTT法测其交叉耐药性和耐药指数,并绘制细胞生长抑制曲线。细胞计数法绘制HCT-8/VCR耐药细胞及其亲本细胞的生长曲线。通过RT-PCR检测sirt1基因的在HCT-8/VCR耐药细胞及其亲本细胞中mRNA的表达水平,采用免疫细胞化学法检测sirt1基因的蛋白表达水平,初步探讨其与肿瘤细胞多药耐药的关系。
结果：
1.人结肠癌长春新碱耐药细胞株HCT-8/VCR耐药水平及其维持情况
采用VCR从低浓度到高浓度逐级递增的作用方法对有初步耐药性的HCT-8/VCR细胞进行耐药培养,2个月后获得了在含2μg/ml的VCR培养液中生长良好的耐药细胞系HCT-8/VCR。MTT法检测HCT-8和HCT-8NCR对长春新碱的IC50分别是:9.77μg/ml和179.47μg/ml,HCT-8NCR的耐药指数(RI)为:18.37。同时HCT-8/VCR对5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50分别是:32.88μg/ml和45.31μg/ml,耐药指数分别为:3.37和4.64,表明HCT-8NCR细胞对长春新碱具有稳定的高度耐药性,并且对5-氟尿嘧啶和顺铂有一定的低度交叉耐药性。
2.细胞形态观察、生长曲线及倍增时间的测定
HCT-8为上皮样细胞,形状多为梭形或多角形,贴壁生长。HCT-8/VCR耐药细胞胞体较亲本细胞大,细胞核不规则,有时可见双核、多形核,细胞形态不规则呈多角形、圆形改变,可见巨核细胞。细胞计数结果HCT-8/VCR和HCT-8的群体倍增时间(double time,DT)分别为36.32±0.43h、31.14±0.45h,显示HCT-8/VCR耐药细胞较HCT-8亲本细胞生长缓慢,DT延长(P<0.05)。
3.RT-PCR结果表明sirt1基因在HCT-8/VCR中mRNA的表达增高
RT-PCR结果显示sirt1基因在HCT-8NCR耐药细胞中和HCT-8亲本细胞中均表达,电泳结果经软件检测HCT-8/VCR耐药细胞和HCT-8亲本细胞灰度值与其相应内参的比值分别是1.81±0.35和1.06±0.32,显示sirt1基因在耐药细胞中mRNA的表达比亲本细胞中的高(P<0.05)。
4.免疫细胞化学结果表明SIRT1在HCT-8/VCR中的表达增高
免疫细胞化学检测结果显示,SIRT1在细胞膜、细胞质和细胞核上均有定位,大部分定位于细胞核中。SIRT1在亲本HCT-8和耐药HCT-8/VCR细胞中均有表达,免疫细胞化学图片经软件检测HCT-8/VCR耐药细胞和HCT-8亲本细胞灰度值分别是118.3±0.46和78.18±0.42,表明sirt1基因在耐药细胞中的表达比亲本中的高(P<0.05)。
结论：
1.成功培养的人结肠癌长春新碱耐药细胞系HCT-8/VCR具有稳定的长春新碱耐药表型,对5-氟尿嘧啶和顺铂有一定程度的交叉耐药性,是研究肿瘤细胞的耐药机制、筛选耐药逆转剂的理想模型。
2.HCT-8/VCR细胞的形态和生长速度等部分生物学特性发生改变。
3. sirt1基因的表达与HCT-8/VCR的耐药性有一定的关系,耐药细胞sirt1的表达明显比亲本细胞中的高,为结肠癌耐药性的研究提供一定的参考依据,为逆转肿瘤细胞的多药耐药提供理论基础。