【摘 要】
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肿瘤是一种复杂、渐进、无序的过程,由遗传和后天的异常导致正常细胞向恶性生物转化。目前癌症仍然是一个世界范围的最大致死疾病。癌症病发死亡率高、疗效不明显的主要因素
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肿瘤是一种复杂、渐进、无序的过程,由遗传和后天的异常导致正常细胞向恶性生物转化。目前癌症仍然是一个世界范围的最大致死疾病。癌症病发死亡率高、疗效不明显的主要因素有癌症机理复杂,无特异性靶点,药物毒副作用大等。癌症传统治疗方式的缺点与不足,促使生物靶点治疗成为研究热点并寄予厚望。实验思路:TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)能诱导被病毒感染的细胞、转化细胞和肿瘤细胞凋亡,而不杀伤正常细胞,这一特点使TRAIL有可能成为靶点治疗癌症的药物,但是TRAIL属于蛋白质,存在生产成本高、运输保存不方便、给药难度大等缺点。因此需要从天然产物中寻找到TRAIL的功能类似化合物。根据配体—受体—募集物复合体荧光成像技术的成功思路,结合TRAIL凋亡通路的特点,确定构建一个稳定表达Procaspase8-GFP融合蛋白的细胞系。TRAIL处理前,荧光均匀分布,TRAIL处理后,荧光发生聚集结合。通过在荧光显微镜下观察荧光的变化,则可以确定所处理的药物有没有TRAIL的功能活性。实验内容与结果:第一步:用分子实验手段构建prc8DED1-DED2-GFP质粒,然后将该质粒转染进入状态良好的U20S细,24 hours后用荧光显微镜观察细胞表达绿色荧光蛋白,发现转染入目标质粒的细胞均已死亡。用Z-VAD-FMK抑制剂预处理细胞后转染目标质粒,并通过MTT、流式细胞仪、western blot证明发现转染入目标质粒的细胞是凋亡死亡的;第二步:构建pCMV6-Procaspase8WT-GFP质粒,然后转染U20S细胞,24 hours后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,发现几乎所有呈绿色的细胞都已经死亡或正在死亡。通过分子实验手段构建了突变体载体pCMV6-Procaspase8 C330A-GFP、pCMV6-Procaspase8D195A,D201A,C330A-GFP、pCMV6-Procaspase8D369A,C330 A-GFP,消除Procaspase8WT的酶活性位点。将三种突变体转染U20S细胞发现细胞的死亡被部分抑制,细胞在10天之后全部死亡,不能得到存活的细胞系。第三步:将Procaspase8的prc8DED1和prc8DED2截断分开后分别结合GFP基因,转染入U20S细胞并在荧光显微下观察,发现有绿色荧光的细胞状态良好,并且绿色荧光均匀分布于细胞内;第四步:向细胞中加入400ug/ml的G418,筛选培养一个月后得到融合蛋白细胞系。最后用TRAIL处理构建好的细胞系并观察荧光的变化,发现prc8DED1-GFP细胞系的绿色荧光有聚集,并且在0～100ng/ml范围随着TRAIL浓度的增加,荧光聚集强度也增加。实验结论:1、Procaspase8可以通过prc8DED1 募集结合FADD;2、Procaspase8的prc8DED1-DED2部分在U20S细胞内表达后,就能导致细胞凋亡;3、Procaspase8的prc8DED 1-GFP在细胞内表达不影响细胞的生存生长;4、prc8DED1-GFP细胞系对TRAIL较敏感,可以在一定范围内用于TRAIL功能类似物的筛选。
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