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羊胎素就是指羊胚胎或胎盘(统称为羊胎)中的活性物质。通过查阅大量的文献资料得知,羊胎中的活性物质主要是小分子多肽类物质。此外,羊胎中也含有丰富的氨基酸,包括人体所必需的8种氨基酸。本文以羊胚胎及胎盘为研究对象,利用超滤法提取其中的主要生物活性成分,对活性成分提取后的剩余蛋白质进行了酶水解,选择了适用于羊胎水解的最适酶种类及最适水解条件。对酶水解液进行了乳酸发酵,筛选出最适发酵菌种及最适发酵条件。并对水提液、水提液+水解液、水提液+发酵液进行了免疫调节功能评价和对比,对水提液(小分子多肽)的加工稳定性进行了研究,并对羊胎素口服液进行了安全性毒理学评价。结果表明: 采用目前较为成熟的超滤法提取羊胎中的活性物质,所得小分子肽为无色或微黄色透明液体,pH6.8~7.2,采用聚丙酰胺凝胶电泳测定其分子量介于3800~10 000Dal之间。紫外扫描分析,最大紫外吸收波长在256nm附近,紫外吸收光密度E260/E280≥2.0,表明该物质为核苷酸和肽类物质,多肽含量为797.22±107.07ug/ml。 以水解度和氮收率为指标,通过中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶4种蛋白酶对羊胎蛋白质水解效率的比较,选择胰酶为水解羊胎的最适酶。通过均匀设计法选得羊胎水解的最适条件为酶用量2.5%(100g原料加胰酶2.5g),底物浓度5.0%(100ml水中加原料5.0g),反应温度40℃,反应时间3h,此时水解度为39.28%。羊胎水解液中含有19种组成蛋白质的氨基酸,包括人体所必需的8种氨基酸,其游离氨基酸总量为45.37mg/ml。 乳酸发酵可脱除羊胎水解液中的苦味和腥味,改善羊胎水解液的感官品质。适用于羊胎水解液发酵的微生物菌种组合为嗜酸乳杆菌1.1854与嗜热链球菌1.1855。通过发酵参数的单因子试验及正交试验得出最优发酵条件为:1.1854与1.1855配比4:1、接种量5%、发酵温度39℃、发酵时间20h、最适糖种类及用量为乳糖2%、发酵起始pH6.5。发酵后水解液中部分与苦味有关的疏水性氨基酸的含量增加,从而使水解液苦味降低。 动物试验表明,低剂量羊胎水提液可抑制SRBC所致的迟发性变态反应,提高小鼠血清溶血素水平,增强小鼠特异性免疫功能;可极显著增强单核-巨噬细胞吞噬功能,增强小鼠非特异性免疫功能,因此具有免疫调节作用。 羊胎蛋白质水解液+水提液或水解液+A酵液对小鼠的非特异性免疫功能较水提液有显著提高(P功.05),也即水解液或发酵液对小鼠的免疫功能具有提高作用。水解液经发酵后与水解液的功能相比无显著提高(P>0.05),但测定值有一定的提高。 温度、。pH、胃蛋白酶对小分子肽的免疫活性有一定的影响.随着温度的升高,小分子肽的免疫活性降低。在 pH3-10的范围内,小分子肽相对稳定,免疫活性变化很小。胃蛋白酶可以将小分子肽水解为游离氨基酸,从而使其活性降低。 大、,1、鼠经口急性毒性试验,羊胎素口服液 LDw均>10.00wg体重,属实际无毒.30天喂养试验表明,较长期受试羊胎素口服液对大鼠生长、发育、血液、生化、病理等指标未见异常,30天喂养最大无作用剂量>5 00()mgh体重。