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目的：将Wnt/β-catenin信号通路作为切入点，以柔肝中药“怀珍养肝胶囊”为干预手段，通过新西兰大白兔ACLT OA模型及兔软骨细胞体外培养干预，采用免疫组化、LCM、Real-timePCR、Western blot、In-cell Western blot等实验技术，探索在OA发生、发展的病理过程中Wnt/β-catenin信号通路的变化，并对“怀珍养肝胶囊”治疗OA的机理进行深入研究。
方法：按完全随机设计方法，将30只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组及治疗组（6只、12只、12只）。并对治疗组动物给予“怀珍养肝胶囊”干预治疗。治疗2周、4周后，分别从模型组与治疗组随机选取1只实验动物处死，取右侧膝关节行LCM技术取材，并立即对捕获的组织进行RNA和蛋白的抽提。应用Real-time PCR、Western blot技术对Col-Ⅱ、MMP-13、Cox-2、Wnt5a、β-catenin在LCM技术捕获软骨细胞中基因与蛋白的表达进行检测。再将各组剩余的5只实验动物处死，亦取右侧膝关节。经固定，脱钙，石蜡包埋，再以膝关节为中心矢状位薄切5μm后，一部分行Safanin-O染色，另一部分行Wnt5a和β-catenin蛋白的免疫组化检测。
采用消化分离法体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞，并以甲苯胺蓝染色及特异性Ⅱ型胶原免疫组化染色进行细胞鉴定。MTT法验证不同浓度HBP-A对软骨细胞增殖的影响。培养基中加入含有浓度为0.5ng/ml的IL-1β，以制造软骨细胞OA模型。采用浓度为0.3mg/ml的HBP-A体外干预OA软骨细胞。应用Real-time PCR、In-cell Western blot技术对Wnt5a、β-catenin、Col-Ⅱ、MMP-13、Cox-2在1、3、5、7天各组软骨细胞中基因与蛋白的表达进行检测。
结果：OA病变积分的形态学观察表明：2周模型组关节软骨表现为早期OA病理改变，4周模型组关节软骨表现为早期近中期OA病理改变。治疗组关节软骨的OA病理改变较模型组轻：组织切片免疫组化结果显示：在模型组中Wnt5a及β-cate nin蛋白皆较正常组表达水平上调，而治疗干预后对Wnt5a、β-cate nin蛋白的表达水平皆有影响；在LCM技术捕获的软骨细胞中，Wnt5a、β-cate nin的基因与蛋白表达水平也表现出相类似的结果。而在Col-Ⅱ、MMP-13、Cox-2的基因与蛋白表达水平上，治疗组也优于模型组。
甲苯胺蓝染色及特异性Ⅱ型胶原染色鉴定证实培养的细胞为软骨细胞；在软骨细胞降解破坏的过程中，Wnt5a、β-catenin的基因与蛋白表达水平是升高的，MMP-13、Cox-2基因与蛋白表达水平亦是上调的，而Col-Ⅱ基因与蛋白表达水平是下调的。治疗组中，Wnt5a、β-catenin、Col-Ⅱ、MMP-13、Cox-2的基因与蛋白表达水平基本优于模型组。
结论：新西兰大白兔ACLT OA模型具有典型OA形态学与分子生物改变，并表现为早期及早期近中期OA病理状态，模型复制成功。该模型适用于OA发病机理、药物治疗方面试验研究，且更加符合中医中“筋萎”这一病机特点。通过这一模型我们观察到：Wnt/β-catenin信号传导通路在整个OA病理过程中具有重要的作用与地位。
通过柔肝中药“怀珍养肝胶囊”对新西兰大白兔ACLT OA模型的治疗干预表明：对于Wnt/β-catenin信号通路有着明显的影响调节作用，特别是能明显地抑制β-catenin的过表达。进而能够促进Col-Ⅱ的表达，抑制MMP-13、Cox-2的表达，起到保护软骨、延缓其退变、以及抗炎镇痛改善OA相关症状。并在OA中期时，显著地促进Wnt5的表达，以维持Wnt/β-catenin信号通路的表达水平，抑制其向低表达转变的趋势，防止OA病理变化由软骨破坏向骨赘形成的方向发展。达到“未病先防”“既病防变”的预防OA、延缓OA进一步发展的目的。
柔肝中药“怀珍养肝胶囊”的单体有效成分精制提取物HBP-A，通过体外对兔软骨细胞OA模型的治疗干预证实：在软骨细胞降解破坏的过程中，Wnt/β-catenin信号通路的表达水平明显上调，而HBP-A对于Wnt/β-catenin信号通路表达水平的改变是有着明显的影响调节作用，能显著地抑制β-catenin的过表达。从而促进Col-Ⅱ的表达，抑制MMP-13的表达，并对Cox-2的基因表达水平也有着明显的抑制作用。进而具有促进软骨细胞合成，有效抑制软骨细胞的降解与破坏及一定抑炎的作用，达到保护软骨细胞及抗炎镇痛改善OA相关症状的目的。