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多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤,约占所有癌症的1%,占血液恶性肿瘤的13%,目前仍无法治愈。随着免疫调节药物的应用,MM患者的预后得到明显改善。分子胶是一类新的治疗药物,它可以结合细胞中的E3泛素连接酶,以疾病相关的蛋白为靶点,对底物蛋白进行蛋白酶体途径的降解。免疫调节药物（IMID）是结合小脑蛋白（CRBN）以改变CRL4（CRBN）E3泛素连接酶功能的经典分子胶,用于治疗多种血液系统恶性肿瘤。最近,一种新的CRBN调节剂CC-885被开发出来,它具有广泛的抗肿瘤活性。虽然翻译终止因子GSPT1的特异性降解对于CC-885的体外抗肿瘤活性是必不可少的,但目前还不清楚是否有其他新的底物也参与了CC-885在肿瘤中特别是在多发性骨髓瘤（MM）的药理作用。在此,我们发现CC-885在体外和体内都可通过抑制细胞周期进程和诱导细胞死亡来抑制MM细胞的生长;CC-885以CRBN依赖的方式选择性地诱导MM细胞中CDK4蛋白的泛素化和降解;CC-885介导的CDK4的下调降低了抑癌基因视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）的磷酸化水平,并阻止了E2F下游基因的表达;重要的是,CDK4的基因消融或药物抑制增强了CC-885对MM细胞的细胞毒作用,提示CDK4的降解与CC-885对MM细胞的细胞毒作用有关。方法1.细胞毒性实验:在96孔板中培养的RPMI8226细胞用不同剂量（6.25-50 n M）的CC-885处理1-3天。每孔加入CCK-8溶液,再孵育4h。然后用微量平板阅读器测量450 nm处的吸光度。2.细胞周期实验:用流式细胞仪检测二甲基亚砜（DMSO）和100 n M CC-885作用于RPMI8226和MM1S细胞24小时后的细胞周期分布。3.细胞凋亡实验:用50或100 n M CC-885处理RPMI8226和MM1S细胞72h。用Annexin-V/PI双染法检测CC-885对骨髓瘤细胞凋亡以及坏死的影响。4.裸鼠成瘤实验:将1x10~7RPMI8226细胞悬浮于无血清培养基中,皮下注射到BALB/CA小鼠。裸鼠移植瘤明显生长后,分成两组,每天分别给予DMSO或CC-885（30 mg/kg）。每隔几天用卡尺测量肿瘤的大小。5.半衰期实验:细胞用100nm CC-885预处理2h后,用放线菌酮（CHX）和CC-885处理MM1S细胞进行免疫印迹分析。6.Western blot实验:不同浓度的CC-885作用于MM1S细胞12小时,利用免疫印迹实验检验CDK4的变化。7.实时荧光定量PCR:检测1μM CC-885作用24h后MM1S细胞中CDK4和5个E2F下游基因的相对表达水平。8.荧光素酶报告实验:将E2F基因的转录调控原件构建入报告基因载体,检测不同浓度的CC-885处理24h后,其荧光素酶活性,即下游信号通路的响应情况。9.CDK4敲低实验:用sh RNA的方法获得敲低CDK4的骨髓瘤细胞,免疫印迹法检测CDK4蛋白水平的变化,实时定量PCR法检测CDK4m RNA水平的变化。CDK4敲低后的的MM1S细胞分别用二甲基亚砜或1μM CC-885处理24小时。然后加入CCK-8,用微量平板阅读器测定A450的吸光度。10.免疫沉淀:将FLAG-CDK4转染293T细胞24小时后,二甲基亚砜、1μM或10μM CC-885在1μM MLN4924存在下再处理24小时。然后收集细胞,并用标志M2珠子进行免疫沉淀,然后用免疫印迹实验检测CDK4以及下游P-RB的蛋白水平变化。结果1.细胞毒性实验:CCK8分析显示CC-885处理导致MM细胞生长抑制,呈剂量和时间依赖性。2.细胞周期实验:与二甲基亚砜（DMSO）处理相比,CC-885处理导致细胞周期阻滞于G1期。3.细胞凋亡实验:CC-885诱导了剂量依赖性的骨髓瘤细胞死亡。4.裸鼠成瘤实验:与对照组相比,CC-885治疗抑制了肿瘤生长并减轻了肿瘤重量。5.半衰期实验:在CC-885存在下,CDK4蛋白的半衰期缩短。6.免疫印迹Western blot实验:CC-885可以下调RPMI8226和U266细胞内源性CDK4蛋白的表达,而不影响其m RNA水平。7.实时荧光定量PCR:CC-885处理显著降低了MM1S细胞中几个E2F下游靶基因的m RNA表达。8.荧光素酶报告实验:CC-885处理以剂量依赖的方式降低了E2F的活性。9.CDK4敲低实验:用两种不同的sh RNA沉默MM1S细胞中的CDK4后,骨髓瘤细胞对CC-885处理敏感性均增加。10.免疫沉淀:在未经处理的细胞中不能检测到CDK4和CRBN之间的相互作用。然而,在CC-885处理后,CC-885可以剂量依赖性地促进CDK4和CRBN之间的相互作用。结论1.CC-885在体外和体内异种移植模型中均显示出抗骨髓瘤活性。2.CC-885选择性地诱导MM细胞CDK4降解。3.CDK4是CC-885依赖于CRBN的新底物。4.CDK4的基因消融或药物抑制增强了CC-885对MM细胞的杀伤作用。