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背景与目的慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以气流受限为特征的疾病,气流受限呈进行性发展,疾病进程多与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD本质上是一种气道炎症性疾病,抗炎治疗是COPD治疗的重要内容。其中糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)是目前最重要、作用最强的抗炎剂,近年来糖皮质激素在COPD患者中的应用日益广泛,但其疗效却不理想,说明在COPD患者中可能存在某种机制,导致糖皮质激素抗炎作用减弱,即糖皮质激素抵抗。糖皮质激素抵抗的相关机制包括组蛋白去乙酰化酶2(Histone deacetylase, HDAC2)活性下降、糖皮质激素受体异常、NF-κB激活通路缺乏等,其中HDAC2活性降低是导致糖皮质激素抵抗的主要原因。HDAC2属Ⅰ型HDAC,只存在于细胞核内,是参与COPD发病的主要亚型,与组蛋白乙酰化酶动态调节炎性基因的激活与转录。组蛋白乙酰化酶催化核心组蛋白分子末端的第5个赖氨酸残基(Lys)乙酰化,使组蛋白带负电荷,与带负电荷的染色质结合疏松,出现DNA解聚效应,招募转录因子,促使炎性基因转录；而HDAC则使组蛋白发生去乙酰化,分子与组蛋白的结合变得更紧密,阻断基因转录。研究证实,COPD大鼠肺组织上皮细胞及炎性细胞的细胞核中HDAC2的表达和活性降低,其主要原因是氧化应激,氧化应激中产生的超氧化阴离子与硝化应激中产生的一氧化氮结合,产生过氧化亚硝酸盐,或硝化HDAC2上的酪氨酸残基,或激活PI3K/AKT通路,磷酸化HDAC2的丝氨酸残基,导致HDAC2蛋白酶体降解失活,HDAC2的活性降低。HDAC2是GC发挥抗炎作用的中介,HDAC2活性的降低,使GC可以募集到基因表达位点的HDAC2减少,组蛋白乙酰化程度增强,炎症基因表达增多,IL-8、TNF-Ω等炎症因子释放增多,GC的抗炎效果削弱。因此增强HDAC2活性是逆转COPD糖皮质激素抵抗的重要靶点。8-异前列腺素F2α (8-iso-PGF2α)是细胞生物膜上花生四烯酸在氧自由基的作用下发生脂质过氧化的产物,其产生不依赖酶途径,且化学性状稳定,因此被用作评价体内氧化应激水平的理想指标.国内外关于8-iso-PGF2α研究仅局限与其与氧化应激水平、炎症水平的相关性,而与HDAC2的相关性鲜有报道。红霉素是大环内酯类抗生素的代表性药物.它除了具有抗菌活性外,还具有明显的抗炎、抗氧化活性,可通过抑制NF-□B、AP-1的活性抑制IL-8的释放和中性粒细胞的活化,还可以减少经香烟烟雾提取物体外诱导的人巨噬细胞产生活性氧。另外,与红霉素同属于大环内酯类抗生素的罗红霉素、阿奇霉素可抑制PI3K/AKT信号通路的激活,而PI3K/AKT信号通路是氧化应激降低HDAC2活性的重要通路。红霉素是否能够通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活抑制氧化应激,增强HDAC2活性,逆转糖皮质激素抵抗,国内外鲜有报道。布地奈德是二代肾上腺皮质激素,可通过雾化吸入途径直接作用于气道,有一定的抗炎作用,可减轻气道粘膜炎症。红霉素与布地奈德联用能否提高布地奈德的局部及全身敏感性,国内外未见报道。本实验采用气道内2次滴入脂多糖加被动吸烟法建立COPD大鼠模型,在模型建立成功的基础上给予红霉素及布地奈德干预,观察红霉素对COPD大鼠HDAC2活性及糖皮质激素抵抗的影响,并探讨PI3K/AKT信号通路在其中的作用。材料与方法健康雄性SD大鼠50只,体重200±20g。随机分为：正常对照组(10只)、COPD组(40只)。COPD组：第1、14天气道内滴入脂多糖,2-13d、15-30d在熏烟箱中被动吸烟。健康对照组：第1、14天气道内滴入生理盐水,2-13d、15-30d在熏烟箱中呼吸空气。模型建立后,将COPD组随机分为COPD模型组、红霉素组、布地奈德组、红霉素+布地奈德组,每组10只。COPD模型组：第31天开始给予生理盐水灌胃,1次/d,2ml/只,共2周。红霉素组：第31天开始给予红霉素灌胃,1次/d,100mg/kg,共2周。布地奈德组：第31天开始雾化吸入布地奈德,1次/d,2ml/只,共2周。红霉素+布地奈德组：第31天开始给予红霉素灌胃,剂量及时间同上,雾化吸入布地奈德,剂量及时间同上。第45天进行肺功能检测,并留取血液及肺泡灌洗液标本,ELISA检测血清及肺泡灌洗液上清中IL-8、TNF-α、8-iso-PGF2a的水平；肺组织进行HE染色以观察肺组织结构变化,Western-blot及免疫组化检测HDAC2、PI3K、 p-AKT的表达。统计学分析：以均数±标准差(x±s)描述数据,两组间比较采用t检验,多组间比较采用采用单因素方差分析。显著性检验水准α=0.05。结果1光镜观察各组大鼠肺组织形态与正常对照组相比,COPD模型组大鼠气管及支气管粘膜上皮细胞脱落,炎性细胞浸润,支气管平滑肌增厚,胶原沉积,肺泡壁变薄,甚至破裂融合成肺大泡。符合人类COPD气管及肺组织病理学变化。各药物干预组大鼠肺组织破坏程度较COPD组轻,其中红霉素+布地奈德组大鼠肺组织破坏最轻。2各组大鼠肺功能变化COPD模型组大鼠,潮气量(TV)、呼气峰流速(PEF)、50%潮气量呼气峰流速(EF50)分别为1.25±0.73ml、18.49±3.24ml/s.1.38±0.21ml/s,显著低于正常对照组[1.87±0.76ml、24.96±11.38ml/s、1.73±1.02ml/s],差异具有统计学意义(P<0.001)。红霉素组[1.68±0.54ml、23.30±10.34ml/s、1.68±0.54ml/s],布地奈德组[1.52±0.88ml、19.62±10.52ml/s、1.47±0.97ml/s]红霉素+布地奈德组[1.72±0.97ml、24.87±10.58ml/s、1.68±0.40ml/s],均高于COPD模型组,且差异具有统计学意义(P<0.001)。3肺泡灌洗液及血清中8-iso-PGF2a水平正常对照组肺泡灌洗液及血清中8-isoPGF2a的值为19.10±0.91ng/ml、31.65±0.45ng/ml, COPD模型组[37.14±0.21ng/ml、40.74±6.86ng/ml]较正常对照组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001)；红霉素组[19.62±0.76ng/ml、28.96±0.55ng/ml],布地奈德组肺泡灌洗液的值(38.14±3.37ng/ml),红霉素+布地奈德组[29.73±0.69ng/ml.19.38±0.74ng/ml]均较COPD模型组明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.001)；但布地奈德组血清中的值(23.50±1.01ng/ml)虽较COPD模型组降低,但差异无统计学意义(P=0.435)；布地奈德组较红霉素组明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)；红霉素+布地奈德组与红霉素组比较,表达水平降低,但差异无统计学意义(P=0.621,0.797)；与布地奈德组比较,表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。4肺泡灌洗液及血清中IL-8、TNF-α水平：正常对照组肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α的值为63.79±3.42ng/L、110.39±9.38ng/L, COPD模型组[127.70±9.32ng/L、280.81±4.48ng/L],较正常对照组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001)；红霉素组[64.97±3.05ng/L117.59±10.71nng/L],布地奈德组[80.31±3.71ng/L、170.78±12.51ng/L],红霉素+布地奈德组[65.47±2.29ng/L、116.86+6.64ng/L],均较COPD模型组明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.001)；布地奈德组较红霉素组明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)；红霉素+布地奈德组与红霉素组比较,表达水平降低,但差异无统计学意义(P=0.787,0.902)；与布地奈德组比较,表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。正常对照组血清中IL-8、TNF-α的值为99.16±2.23ng/L、240.70±6.68ng/L,COPD模型组[153.82±2.21ng/L、436.76±3.33ng/L],高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。红霉素组[110.60±4.33ng/L、275.00±8.28ng/L],红霉素+布地奈德组[102.11±2.35ng/L、252.15±7.95ng/L],均低于COPD模型组,差异有统计学意义(P<0.001)；布地奈德组[134.97±2.67ng/L、398.68±7.71ng/L],低于COPD模型组,但差异无统计学意义(P==0.693,0.505)；布地奈德组较红霉素组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.001)；红霉素+布地奈德组显著低于红霉素组、布地奈德组,且差异具有统计学意义(P<0.001)。5肺组织中HDAC2、PI3K、p-AKT、免疫组化：HDAC2多表达在支气管黏膜上皮细胞、血管上皮细胞、肺泡上皮细胞及肺泡巨噬细胞的细胞核。PI3K、p-AKT主要表达于支气管上皮细胞、气道平滑肌细胞及炎性细胞。与正常对照组相比较,COPD模型组HDAC2表达强度降低,PI3K、p-AKT表达增强,差异具有统计学意义P<0.001)。红霉素组、红霉素+布地奈德组与COPD模型组相比较,HDAC2表达强度增强,PI3K、p-AKT的表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.001)。布地奈德组与COPD模型组比较,HDAC2表达增强,PI3K、p-AKT的表达降低,但差异无统计学意义(P=0.145、0.203、0.178)；布地奈德组与红霉素组比较,HDAC2表达强度降低, PI3K、p-AKT表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。红霉素+布地奈德组与红霉素组相比较,HDAC2表达增强,PI3K、p-AKT表达减弱,但差异无统计学意义(P=0.308、0.524、0.252)；与B相比较,PI3K、p-AKI表达明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。6肺组织中HDAC2、PI3K、p-AKT蛋白水平与正常对照相比较,COPD模型组HDAC2蛋白表达强度降低,PI3K、p-AKT表达增强,差异具有显著性(P<0.001)。红霉素组、红霉素+布地奈德组与COPD模型组相比较,HDAC2蛋白表达强度增强,PI3K、p-AKT的表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。布地奈德组与COPD模型组比较,HDAC2表达增强,PI3K、p-AKT的表达降低,但差异无统计学意义(P=0.423、0.706、0.693)；布地奈德组与红霉素组比较,HDAC2表达强度降低,PI3K、p-AKT表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。红霉素+布地奈德组与红霉素组相比较,HDAC2表达增强,PI3K、p-AKT表达明显减弱,但差异无统计学意义(P=0.525、0.533、0.464)；与布地奈德组相比较,HDAC2表达增强,PI3K、p-AKT表达明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.001)。7肺组织中HDAC2活性与血清(B)及肺泡灌洗液(F)中8-iso-PGF2α、 IL-8、TNF-α水平及肺组织中PI3K、P-AKT活性的相关性分析肺组织中HDAC2蛋白水平与血清、肺泡灌洗液中8-iso-PGF2a水平均呈负相关,Spearman相关系数rSB=-0.985,rSF=-0.834(P<0.001)。肺组织中HDAC2蛋白与血清、肺泡灌洗液中IL-8水平呈负相关,rSB=-0.974,rSF=-0.886(P<0.001)；与TNF-α的水平呈负相关,rSB=-0.856,rSB=-0.841(P<0.001)。肺组织HDAC2蛋白与P13K蛋白的表达呈负相关,rs=-0.98,P<0.05与p-AKT蛋白呈负相关,相关系数rs=-0.94(P<0.001)。结论1、气道内2次(第1、14天)滴入脂多糖联合连读被动吸烟28天能成功复制COPD大鼠模型。2、COPD大鼠体内存在氧化应激、炎症损伤及糖皮质激素抵抗,红霉素能够抑制氧化应激、抑制炎症因子的产生,与布地奈德合用可显著提高其抗炎作用。3、COPD大鼠肺组织中HDAC2表达减少,氧化应激及PI3K/AKT通路可能参与对HDAC2活性的负性调节4、红霉素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路增强COPD大鼠肺组织中HDAC2活性,逆转糖皮质激素抵抗。