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microRNA(miRNA)是在真核生物中普遍存在的一类非编码小RNA分子,它们能够通过调控下游靶标参与着各种重要的生长发育事件,主要包括维持基因组稳定性、调控生长发育进程以及抵御外来生物的侵扰。尽管拟南芥中已经发现了大量的miRNAs分子,但水稻作为单子叶模式植物和重要的经济作物,miRNA的发现以及其调控机制还处于探索阶段,尤其是与环境胁迫相关的miRNA的发现及其功能研究仍知之甚少。
为了获得与环境胁迫相关的miRNA,我们构建了水稻幼苗的small RNA库,包括脱落酸(ABA,abscisic acid)、寒冷、干旱、高盐处理以及未处理的对照组。miRNA二级颈环结构预测和靶基因预测,结合对比植物small RNA芯片中的表达数据,以及后续的northern表达鉴定,确定了7个新的与水稻环境胁迫相关的miRNAs,将它们依次命名为miR2001-miR2007。这些miRNAs表达量低,在拟南芥中亦未发现同源的miRNA,这些特征表明我们获得的是非保守的、水稻特异的miRNAs。
对其中microRNA2001(miR2001)进行了相关功能研究。northern杂交表达鉴定表明,miR2001表达受高盐胁迫诱导,其表达随盐胁迫处理时间延长而升高,且此表达过程不依赖于ABA；另外,水稻miR2001在环境胁迫处理时具有组织特异性。
为了研究胁迫诱导miRNA的生物学功能,我们在水稻中克隆得到miR2001的基因,构建了miR2001的过表达载体,获得了过表达转基因水稻植株,并对其进行表型观察以及生物学分析。RT-PCR及northern杂交结果显示miR2001的前体及其成熟的miRNA分子在转基因植株中表达量升高。正常生长条件下转基因植株表型与转空载体对照植株相比没有明显差异,但过表达miR2001的幼苗在300mM NaCl高盐处理下表现出良好的耐逆性,且过表达miR2001的种子在不同浓度高盐或高渗透胁迫处理情况下,表现出萌发率高且种子根长生长迅速的耐逆性状。生理指标检测结果显示,胁迫处理后过表达miR2001幼苗体内脯氨酸含量高于对照组幼苗。这些结果表明,过表达miR2001增加了水稻的耐盐、耐渗透能力。
为了从调控基因的角度进一步研究miRNA在水稻胁迫下的功能,通过RLM-RACE、全基因组芯片、real-time PCR等技术手段对miR2001调控的下游基因及进行了分析。RACE和全基因组芯片结果显示,在过表达miR2001水稻中预测的miR2001靶基因没有受到剪切作用,也没有转录水平上的表达量变化。但同时全基因组芯片分析和RT-PCR,real-time PCR验证,显示OsLEA基因家族、DREB1、LIP9、CycP450等一些胁迫基因在过表达miR2001的水稻植株中表达量有明显变化,另外过表达miRNA2001影响了由CPDK到DREB调控基因的胁迫信号途径。证明过表达miR2001通过调控下游胁迫基因的表达影响了水稻对盐胁迫的耐受性,提高了水稻的耐盐能力。另外本研究通过构建水稻降解组库,捕获在体内受miRNA剪切调控的靶基因,分离并分析获得了水稻盐胁迫处理后受调控的靶基因。