论文部分内容阅读
目的：
视锥-视杆细胞营养不良（Cone-rod dystrophy，CORD）是一种遗传性视网膜疾病。CORD主要特征为视锥感光细胞和视杆感光细胞的功能逐渐丧失并死亡。在受损程度上，以视锥细胞的功能丧失最为明显，随之是视杆细胞功能的逐渐缺失，但视杆细胞功能受损程度与视锥细胞相似或较轻。CORD属于遗传性视网膜疾病（IRD）。目前，已有超过270个基因与IRD有关，IRD疾病的遗传异质性使得诊断和治疗具有挑战性。尽管国内外已经报道了多个基因突变会导致常染色体显性视锥-视杆细胞营养不良（adCORD），但是adCORD的遗传病因尚未完全被阐明。在这项研究中，我们探讨了ATP1A3基因是否与adCORD有关，从而有助于进一步阐明CORD的潜在发病机制。
方法：
通过全外显子测序技术及生物信息学分析方法在一个患有视锥-视杆细胞营养不良疾病的家族中探索其可能存在的新的致病基因。并运用家系共分离验证、突变致病性预测、正常人群数据库筛查、基因表达数据库以及基因功能GO分析筛选本家系的候选致病基因。通过RNA测序以定量分析候选致病基因（ATP1A3）在小鼠视网膜中的表达水平。通过各类数据库分析该基因编码的蛋白在各个组织中的表达量，尤其是视网膜中的表达情况。使用细胞能量代谢分析仪（Seahorse XFp）检测ATP1A3突变细胞的耗氧率（OCR）。通过加入线粒体呼吸产能过程中的通路抑制剂和激活剂，可以检测线粒体氧化产能过程中各个环节的具体情况。该耗氧率反映了细胞线粒体呼吸和储备能量的能力。通过视网膜电图（ERG）检测ATP1A3突变小鼠的视网膜功能。ERG检测结果能反映视锥细胞和视杆细胞各自的视觉功能变化。
结果：
通过全外显子测序技术，我们在一个患有显性视锥-视杆细胞营养不良疾病的家族中发现了一个新的致病基因，ATP1A3。ATP1A3蛋白编码Na+，K+-ATPase的α3亚基。而Na+，K+-ATPase在细胞稳态的维持中起到至关重要的作用。其能维持细胞膜内外Na+和K+的离子浓度平衡。此外，通过RNA测序发现小鼠视网膜中Atp1a3在不同时期表达量都非常高。而过表达突变型ATP1A3蛋白的Hela细胞出现耗氧率（OCR）降低的现象，反映了线粒体受到一定影响。基于这个体外实验结果，我们制作了ATP1A3突变的小鼠模型。经免疫荧光检测和qRT-PCR检测，证明该小鼠模型成功地过表达突变的ATP1A3蛋白。免疫荧光染色结果表明，ATP1A3在WT小鼠视网膜的感光细胞内节和视网膜内层（内丛状层，视网膜神经纤维层，神经节细胞层）中表达。而在ATP1A3突变小鼠视网膜中，ATP1A3在感光细胞内节区域高度表达。该结果揭示ATP1A3对视网膜正常生理功能起到至关重要作用，尤其是视锥细胞和视杆细胞。但3月龄的ATP1A3突变小鼠没有表现出明显的视网膜功能丧失。ERG振幅没有出现明显降低，OCT扫描结果也没有发现视网膜各层厚度发生改变。但12月龄的老龄突变小鼠则表现出较明显的ERG振幅降低。其中明适应反应的振幅下降比暗适应反应的振幅下降要显著一些，揭示视锥细胞的功能先受到影响，随后是视杆细胞的功能受到些许影响。
结论：
综上所述，ATP1A3突变可能是导致常染色体显性遗传的视锥-视杆细胞营养不良的新致病基因。同时揭示ATP1A3在视网膜中起到重要作用。
视锥-视杆细胞营养不良（Cone-rod dystrophy，CORD）是一种遗传性视网膜疾病。CORD主要特征为视锥感光细胞和视杆感光细胞的功能逐渐丧失并死亡。在受损程度上，以视锥细胞的功能丧失最为明显，随之是视杆细胞功能的逐渐缺失，但视杆细胞功能受损程度与视锥细胞相似或较轻。CORD属于遗传性视网膜疾病（IRD）。目前，已有超过270个基因与IRD有关，IRD疾病的遗传异质性使得诊断和治疗具有挑战性。尽管国内外已经报道了多个基因突变会导致常染色体显性视锥-视杆细胞营养不良（adCORD），但是adCORD的遗传病因尚未完全被阐明。在这项研究中，我们探讨了ATP1A3基因是否与adCORD有关，从而有助于进一步阐明CORD的潜在发病机制。
方法：
通过全外显子测序技术及生物信息学分析方法在一个患有视锥-视杆细胞营养不良疾病的家族中探索其可能存在的新的致病基因。并运用家系共分离验证、突变致病性预测、正常人群数据库筛查、基因表达数据库以及基因功能GO分析筛选本家系的候选致病基因。通过RNA测序以定量分析候选致病基因（ATP1A3）在小鼠视网膜中的表达水平。通过各类数据库分析该基因编码的蛋白在各个组织中的表达量，尤其是视网膜中的表达情况。使用细胞能量代谢分析仪（Seahorse XFp）检测ATP1A3突变细胞的耗氧率（OCR）。通过加入线粒体呼吸产能过程中的通路抑制剂和激活剂，可以检测线粒体氧化产能过程中各个环节的具体情况。该耗氧率反映了细胞线粒体呼吸和储备能量的能力。通过视网膜电图（ERG）检测ATP1A3突变小鼠的视网膜功能。ERG检测结果能反映视锥细胞和视杆细胞各自的视觉功能变化。
结果：
通过全外显子测序技术，我们在一个患有显性视锥-视杆细胞营养不良疾病的家族中发现了一个新的致病基因，ATP1A3。ATP1A3蛋白编码Na+，K+-ATPase的α3亚基。而Na+，K+-ATPase在细胞稳态的维持中起到至关重要的作用。其能维持细胞膜内外Na+和K+的离子浓度平衡。此外，通过RNA测序发现小鼠视网膜中Atp1a3在不同时期表达量都非常高。而过表达突变型ATP1A3蛋白的Hela细胞出现耗氧率（OCR）降低的现象，反映了线粒体受到一定影响。基于这个体外实验结果，我们制作了ATP1A3突变的小鼠模型。经免疫荧光检测和qRT-PCR检测，证明该小鼠模型成功地过表达突变的ATP1A3蛋白。免疫荧光染色结果表明，ATP1A3在WT小鼠视网膜的感光细胞内节和视网膜内层（内丛状层，视网膜神经纤维层，神经节细胞层）中表达。而在ATP1A3突变小鼠视网膜中，ATP1A3在感光细胞内节区域高度表达。该结果揭示ATP1A3对视网膜正常生理功能起到至关重要作用，尤其是视锥细胞和视杆细胞。但3月龄的ATP1A3突变小鼠没有表现出明显的视网膜功能丧失。ERG振幅没有出现明显降低，OCT扫描结果也没有发现视网膜各层厚度发生改变。但12月龄的老龄突变小鼠则表现出较明显的ERG振幅降低。其中明适应反应的振幅下降比暗适应反应的振幅下降要显著一些，揭示视锥细胞的功能先受到影响，随后是视杆细胞的功能受到些许影响。
结论：
综上所述，ATP1A3突变可能是导致常染色体显性遗传的视锥-视杆细胞营养不良的新致病基因。同时揭示ATP1A3在视网膜中起到重要作用。