【摘 要】
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ABC(ATP-binding cassette)家族是真核和原核生物机体中存在的最大的蛋白超家族之一。本研究克隆了苏云金芽胞杆菌(Bacilllus thuringiensis,Bt)BRC-HZP7中位于chiA下游与其
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ABC(ATP-binding cassette)家族是真核和原核生物机体中存在的最大的蛋白超家族之一。本研究克隆了苏云金芽胞杆菌(Bacilllus thuringiensis,Bt)BRC-HZP7中位于chiA下游与其相距较近的ABC基因,命名为ABC-1,并克隆绿色荧光蛋白Gfp基因,构建融合表达载体pET32a-Gfp-ABC-1,导入大肠杆菌BL21中进行表达。通过细胞破碎将诱导表达后的菌株pET32a-Gfp-ABC-1成分分离镜检,并通过SDS-PAGE及膜蛋白提取,证实ABC-1转运蛋白在行使功能时是定位于细胞膜上的。利用在线软件对ABC-1进行生物信息学结构分析。结构分析中显示α螺旋在ABC-1所占的比例最大(47.39%),推测该ABC-1蛋白是正向“半分子”的转运模型:NBD-TMD。这些α螺旋聚集在一起,呈现出一个类似的“通道”构象,该结构可能形成了溶质跨膜的通道。预测结果显示该单体是通过形成二聚体的形成来发挥功能蛋白的作用。选取 pET32a、pET32a-Gfp、pET32a-ABC-1、pET32a-Gfp-ABC-1 四种菌株进行生长曲线的测定,显示在LB培养基中含有ABC-1基因菌株的生长量相较与对照菌株提高了170.81%。用蛋白胨和酵母提取物分别作为主要营养物质,生长量分别提高了 58.3%和61.1%。可以推测,ABC-1的存在可能更有利于菌株利用营养物质从而提高生长量。在菌株生长有机碳源筛选中,选取4种单糖:葡萄糖、果糖、半乳糖和阿拉伯糖,结果显示ABC-1可能并不以糖类作为转运底物。在有机氮源中筛选,选取了4种氨基酸:甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。结果显示ABC-1对赖氨酸和精氨酸有较高的亲和性,生长量相较与对照菌株分别提高了19.52%和38.66%。在探究ABC-1和几丁质酶可能的功能相关性,选用NAG作为筛选的营养物质进行培养,结果显示ABC-1对NAG有很高的亲和性,生长量相较与对照菌株提高了85.3%,表明NAG很有可能是ABC-1蛋白的运输底物之一,同时参考ABC-1和儿丁质酶的位置关系,ABC-1和几丁质酶具有功能相关的可能性进一步的提高。目前国内对于苏云金芽胞杆菌基因组中ABC基因进行的功能鉴定,尚未见报道。本研究对于ABC-1基因的功能定位以及分子模型的探究对于今后对Bt基因组中其它的ABC基因进行分析研究提供了参考,同时对通过改造ABC基因进而影响几丁质酶的表达的新思路的可行性提供了借鉴,对提高Bt杀虫活性有重大意义。
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