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乳酸菌表达系统最突出的特点是宿主菌为公认的食品级微生物,有着长期用于食品的悠久历史,属于食品级表达系统;大肠杆菌具有遗传背景清楚、操作简单等优点,因此这两种原核微生物都是广泛用于基因工程的宿主菌。利用枯草芽孢杆菌来源的自诱导型启动子PsrfA构建枯草芽孢杆菌表达系统,可实现多种异源蛋白的高效表达。因此,为利用乳酸菌及大肠杆菌表达宿主的优势,开发基于启动子PsrfA的大肠杆菌及乳酸菌表达系统,本论文构建了含PsrfA的大肠-乳酸菌穿梭载体,转入大肠杆菌及乳酸菌,研究PsrfA对宿主及目的蛋白的表达适用性、不同因素对启动子表达活性的影响及表达系统的应用。主要研究内容如下:(1)构建大肠杆菌表达系统。以荧光蛋白GFP和β-半乳糖苷酶为报告基因,分别连入启动子PsrfA下游,构建表达载体后分别转入E.coli JM109和E.coli BL21后检测报告蛋白的表达。对含GFP为报告蛋白的重组菌,通过激光扫描共聚焦显微镜观察、荧光强度检测及SDS-PAGE分析,启动子PsrfA在重组E.coli JM109和E.coli BL21中均能表达荧光蛋白GFP;将启动子PsrfA的核心区-10区(TAAACT)突变为保守序列(TATAAT)后,GFP在重组E.coli JM109和E coli BL21中的表达量分别提高了 5.6倍和2.8倍。对重组菌发酵上清进行检测,四株重组菌发酵上清中均能检测到荧光强度和对应的蛋白条带,其中E.coli BL21-02的发酵上清中检测到的荧光蛋白GFP的表达量最高为24449.91。对含β-半乳糖苷酶为报告蛋白的重组菌,通过检测β-半乳糖苷酶酶活及SDS-PAGE分析;启动子PsrfA均能在E.coli JM1 09和E.coli BL21中表达β-半乳糖苷酶,将启动子PsrfA的核心区-10区突变为保守序列后,β-半乳糖苷酶酶活的表达量在E.coli JM109和E.coli BL21中分别提高了 1.2倍和1.3倍。(2)启动子PsrfA在乳酸菌中表达特性的研究。将含有PsrfA-gfp的表达载体分别转入 Lactobacillus casei 5257,L.plantarum 97,L.fermentum 087,和Weissella confuse 10中,并改变培养基的碳源和氮源、培养基的初始pH和发酵过程中发酵液的pH,结果显示,启动子 PsrfA在 L.casei 5257、L.plantarum 97、L.fermentum 087 和 W.confusa 10中均能表达荧光蛋白GFP;不同碳源和氮源不仅影响菌体生长而且还可影响启动子PsrfA的表达活性,启动子PsrfA在以L.plantarum97为宿主、麦芽糖为碳源的培养基中荧光蛋白GFP的表达量最高;调节培养基的初始pH对启动子PsrfA的表达影响较低;在发酵过程中维持培养基的pH在4.5以上,启动子PsrfA在L.pantarum 97和L.casei 5257中的表达活性增强。(3)乳酸菌表达系统的应用。(a)利用PsrfA在L.plantarum 97和L.casei 5257表达NADH氧化酶来提高乳酸菌发酵液的pH。重组菌中检测到的NADH氧化酶酶活和发酵液pH均高于野生菌。对启动子PsrfA的核心保守区-35区、-10区、核糖体结合位点、抑制因子CodY结合位点等进行突变,结果表明,通过这几种方式对启动子PsrfA进行突变后,都能够提高重组乳酸菌表达NADH氧化酶,从而提高发酵液的pH。对启动子PsrfA的核心区-35和-10区同时进行突变后,培养15h时,测定L.plantarum 97-09表达NADH氧化酶的活力为42.65 U/mg,发酵液pH相比于对照L.plantarum 97提高了 0.32;测定L.casei 5257-09表达NADH氧化酶的活力为18.73 U/mg,发酵液pH相比于对照 L.casei 5257 提高了 0.20。(b)利用 PsrfA在L.plantarum 97 和L.casei 5257 表达枯草芽孢杆菌来源的漆酶CotA。结果显示,含PsrfA-cotA的重组菌L.plantarum 97-06和L.casei 5257-06均能够表达漆酶CotA且L.plantarum 97-06表达漆酶CotA的活力高于L.casei 5257-06;培养过程中调节发酵液的pH,L.plantarum 97-06表达的漆酶活力提高了 2.8倍,L.casei 5257-06表达的漆酶活力提高了 1.6倍。