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食管癌是世界上常见的恶性肿瘤,已经成为全球死亡的主要原因之一,且发病有明显的地域和组织学类型上的差异。根据全国肿瘤登记中发布的数据,我国食管癌发病率为恶性肿瘤发病率的第四位,己成为威胁人民健康的重大公共卫生问题。目前认为食管癌是多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病,有多个癌基因和抑癌基因多途径综合作用的结果。因此,寻找更多有效的食管癌相关肿瘤标志物及食管癌治疗的潜在靶点,对降低食管癌的发病率和死亡率有重要的现实意义。果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是表观遗传调控因子Polycomb group(PcG)蛋白家族重要成员,其与SUZ12和EED共同组成PRC2蛋白复合物(核心催化亚基),具有高度保守的甲基转移酶活性,通过调节核小体组蛋白第27位赖氨(H3K27)三甲基化作用诱导沉默具有分化能力的PRC2靶基因,从而参与表观遗传学和基因表达的调控。人黑色素瘤抗原-A(melanoma-associated antigen gene,MAGE)属于癌睾抗原,它编码的肿瘤排斥抗原在细胞内加工后产生一种抗原肽,并与人类白细胞抗原Ⅰ类分子(human leucocyte antigene-I,HLA-I)发生结合形成复合物,被自体细胞毒性T细胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)所识别,诱导相应的肿瘤细胞被进行特异性杀伤,以达到治疗肿瘤的目的。因此,MAGE是一种CTL介导的肿瘤特异性免疫治疗的理想靶分子。越来越多的实验证明,一些表遗传学机制如DNA甲基化和组蛋白甲基化、乙酰化,在调节MAGE-I基因表达上起到了重要作用。前期研究结果显示,DNA甲基化及组蛋白共价修饰涉及各种肿瘤基因的沉默,促进肿瘤发生或者人类癌症的进展。其中最重要的机制是通过EZH2沉默多种癌症相关基因,EZH2可以使靶基因启动子处组蛋白H3赖氨酸K27发生三甲基化。在本研究中,我们探讨了EZH2促进食管癌进展的可能机制,以及对肿瘤抗原MAGE-A11的表观调控机制。我们首先利用CCK-8增殖和克隆形成实验检测EZH2对食管癌增殖、克隆等生物学功能的影响;并应用染色质免疫共沉淀等实验方法对EZH2与MAGE-A11间的相互作用进行了研究。主要研究内容和结果如下:第一部分EZH2基因对人食管癌细胞增殖的影响目的:探讨过表达或沉默EZH2基因对食管癌细胞增殖的影响。方法:选用人食管癌细胞株ECA109、TE1、KYSE30、KYSE170作为研究对象。1)采用实时荧光定量PCR(qPCR)、Western blotting法分别检测食管癌细胞EZH2 mRNA和蛋白的表达水平。2)然后采用qPCR检测过表达和沉默EZH2基因后对4株食管癌细胞EZH2 mRNA的表达变化。3)CCK-8增殖实验、克隆形成实验检测过表达和沉默EZH2基因及EZH2抑制剂DZNep处理对食管癌细胞增殖能力和克隆形成率的影响。结果:1)食管癌ECA109、TE1细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平明显高于KYSE30、KYSE170细胞(P<0.05)。2)食管癌TE1、ECA109细胞转染EZH2-ShRNA后EZH2表达水平下调(均P<0.05)、细胞增殖能力降低(1.07±0.08 vs 1.59±0.09,P<0.05;0.88±0.08 vs 1.05±0.11,P<0.05)、克隆形成数下调[(200.00±11.43)vs(480.00±13.10)个,P<0.05;(88.00±8.16)vs(220.00±14.69)个,P<0.05]。3)KYSE30、KYSE170细胞转染EZH2过表达质粒后EZH2表达水平升高(均P<0.05)、细胞增殖能力显著增强(1.06±0.07 vs 0.76±0.06,P<0.05;3.36±0.30 vs 1.50±0.08,P<0.05)、克隆形成数显著升高[(45.00±3.27)vs(18.00±1.63]个,P<0.05;(65.00±4.08)vs(23.00±2.45)个,P<0.05]。4)DZNep处理后,ECA109和TE1细胞增殖能力降低(t=21.29,16.83,均P<0.05)、克隆形成数下降[(200.00±6.53)vs(500.00±16.33)个,t=24.12,P<0.05;(80.00±10.88)vs(480.00±8.98)个,t=34.22,P<0.05]。小结:敲低EZH2基因表达或应用EZH2抑制剂DZNep使食管癌增殖能力和克隆形成率降低;过表达EZH2能有效促进食管癌细胞的增殖和克隆形成能力。第二部分食管癌细胞中EZH2对MAGE-A11的表达调控目的:探索食管癌细胞中EZH2对MAGE-A11表达的影响及其相互作用的内在机制。方法:1)采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测各食管癌细胞系MAGE-A11表达情况,以及去甲基化剂DAC对MAGE-A11表达的影响。2)采用染色质免疫共沉淀实验方法分析组蛋白H3K27me3对MAGE-A11启动子在食管癌细胞中转录调控作用。3)采用q PCR和Western Blot方法检测敲低EZH2对MAGE-A11表达的影响。4)DAC与DZNep联合用药对食管癌Eca109和TE13细胞中MAGE-A11 mRNA和蛋白水平的表达影响。结果:1)食管癌Eca109和KYSE30细胞显示出MAGE-A11 mRNA相对低表达(P<0.05);而TE13细胞显示MAGE-A11 mRNA相对高表达(P<0.05)。2)在MAGE-A11低表达的Eca109和KYSE30细胞中,去甲基化剂DAC对MAGE-A11诱导显著(P<0.05);而在MAGE-A11高表达的TE13细胞中,只显示出DAC对MAGE-A11轻微的诱导。3)Eca109细胞中MAGE-A11启动子上的沉默标记物占比较多,如H3K27me3,H3K9me3;而激活标记物H3K4me3占比较少。相反,TE13细胞中MAGE-A11启动子上的沉默标记物占比降低,如H3K27me3,H3K9me3;而激活标记物H3K4me3占比增加。DAC处理Eca109细胞使得H3K27me3和H3K9me3与MAGE-A11启动子结合力降低,而H3K4me3与MAGE-A11启动子结合增强。4)在Eca109细胞中敲低EZH2或应用DZNep处理后,H3K27me3在MAGE-A11启动子上的表达明显下降。5)敲低EZH2表达后,Eca109细胞中MAGE-A11表达明显增高。6)在MAGE-A11高甲基化的Eca109细胞中,DZNep与DAC联合药物使MAGE-A11 mRNA表达增高,且显著高于单独DZNep用药;而在MAGE-A11低甲基化的TE13细胞中,DZNep与DAC联合药物或DZNep单独用药均对MAGE-A11 mRNA表达没有显著影响。小结:1)食管癌Eca109和KYSE30细胞显示出MAGE-A11高甲基化状态;TE13处于MAGE-A11低甲基化状态。2)在高甲基化的Eca109细胞中,EZH2通过介导组蛋白H3K27me参与了MAGE-A11启动子的转录调节。结论:EZH2可促进食管癌细胞的增殖和克隆形成能力,并且在MAGE-A11基因高甲基化食管癌细胞中,EZH2介导的组蛋白H3K27me3甲基化参与了MAGE-A11启动子的转录调节。EZH2异常的过表达能够充当食管癌病人预测不良预后指标,并且阻断EZH2的表达,或许可以为ESCC治疗提供新的策略。