【摘 要】
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胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES)首次从小鼠胚胎中成功分离以后，一直成为各国学者研究的热点。ES细胞作为一种新型的实验材料，广泛应用于发育生物学研究、真核细胞基因的表
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胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES)首次从小鼠胚胎中成功分离以后，一直成为各国学者研究的热点。ES细胞作为一种新型的实验材料，广泛应用于发育生物学研究、真核细胞基因的表达与调控、人类遗传病动物模型的创建以及动物克隆和转基因动物的生产等。获得大量体外培养条件下保持未分化状态和发育全能性的ES细胞并在体外建立可长期传代的ES细胞系，是研究ES细胞的重要目的之一。目前已经建立了小鼠胚胎干细胞系，兔ES细胞建系的研究正在深入。国外有兔类。ES细胞系建立，但还不是真正意义上的兔ES细胞系。本论文以日本大耳白兔为材料，从中获取早期胚胎和胎儿，然后从内细胞团和生殖嵴中分离培养兔类ES细胞，并进行传代和鉴定，对影响兔内细胞团贴壁、增殖、类ES细胞传代和抑制分化的因素进行了探讨，为完善日本大耳白兔ES细胞建系技术路线提供资料。主要实验结果如下：
(1)试验比较了细胞悬浮培养法和组织块培养法培养小鼠胎儿成纤维细胞的效率，发现组织块培养法是一种简便高效的培养方法；试验甩10μg/mL丝裂霉素c处理2h即可有效抑制小鼠胎儿成纤维细胞增殖而不影响其活性。
(2) 以未处理胚为对照组，对胚胎进行切割后将含内细胞团的部分接种在饲养层；或用链霉蛋白酶E消化掉家兔早期胚胎的外层粘蛋白和部分透明带，然后接种于饲养层；或把内细胞团细胞离散后接种，发现消化后接种的胚胎内细胞团能够较快贴壁、增殖而不分化。
(3)把72h和96h胚龄的胚胎消化处理后接种于饲养层，96h胚龄的胚胎内细胞团贴壁率更高(P<0.05)，最高传至5代，适合体外分离培养兔类胚胎干细胞。
(4)试验比较了自然发情和超排所获胚胎在饲养层上贴壁和传代情况。超排处理获得的胚胎内细胞团贴壁率及和可传代比率与自然发情组无显著差异；但是获得可用胚胎的绝对数量和可传代的内细胞团绝对数量多，可用于分离兔类：ES细胞。
(5) 向含白血病抑制因子的条件培养液中分别加入1mg/mL和10mg/mL胰岛素，不加胰岛素组为对照组。与对照组相比，实验组胚胎96h贴壁率、可传代的内细胞团比率有所提高，但是无显著差别(P>0.05)，而10mg/mL胰岛素组传能够成功传第1代的胚胎比率较其它两组高(P<0.05)，传至5代的胚胎比率最高(P<0.05)。
(6) 以含白血病抑制因子条件培养基作为培养液，比较小鼠胎儿成纤维细胞和兔胎儿成纤维细胞作为饲养层对内细胞团贴壁和增殖的影响，发现小鼠胎儿成纤维细胞和兔胎儿成纤维细胞作饲养层均能获得类ES细胞集落(P>0.05)，但是小鼠胎儿成纤维细胞能够更稳定的支持兔胚胎内细胞团贴壁和传代。
(7)胎龄为17天的兔胎儿生殖嵴消化后置于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养，能获得较多类ES细胞集落且最长传至第四代。胎龄为17天的兔胎儿可用于从生殖嵴分离类Es细胞。
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