【摘 要】
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百合（Lilium spp.）原产于我国,性喜冷凉湿润的生长环境,较耐低温但耐热性较差。在温度高于30℃的环境下,百合常表现出瘦弱、矮小等现象,严重影响了百合切花的产量和品质。因此,解析耐热百合品种的高温响应机制对百合切花生产具有重大意义。目前有关转录调控因子在百合耐热方面的研究主要集中在热激转录因子（heat stress transcription factors,HSFs）,而有关WRKY转
【基金项目】
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江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目（2016-NY-077）; 国家自然科学基金项目（31902055）; 江苏省自然科学基金项目（BK20190532）
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百合（Lilium spp.）原产于我国,性喜冷凉湿润的生长环境,较耐低温但耐热性较差。在温度高于30℃的环境下,百合常表现出瘦弱、矮小等现象,严重影响了百合切花的产量和品质。因此,解析耐热百合品种的高温响应机制对百合切花生产具有重大意义。目前有关转录调控因子在百合耐热方面的研究主要集中在热激转录因子（heat stress transcription factors,HSFs）,而有关WRKY转录因子在百合高温响应机制方面的研究还未见相关报道。本试验选用麝香百合杂种系‘白天堂’作为研究材料,从其叶片中分离得到了LlWRKY39基因,并对其基因的表达模式及其在热胁迫调控网络中的作用进行研究分析。主要研究结果如下:（1）从麝香百合‘白天堂’叶片中分离得到LlWRKY39基因,其开放阅读框（Open reading frame,ORF）为858 bp,预测编码285个氨基酸;与拟南芥（Arabidopsis thaliana）WRKY家族进行系统进化树分析,发现与AtWRKY39亲缘关系较近且属于WRKY-Ⅱd家族;与同为单子叶植物的小麦、水稻、二穗短柄草、海枣、油棕、凤梨、苹果、番茄的WRKY39同源基因进行系统进化树分析。结果显示其与凤梨AcWRKY39同源性最高,亲缘关系最近。（2）蛋白亚细胞定位结果表明LlWRKY39定位在细胞核,转录激活实验显示在酵母细胞中LlWRKY39无转录激活活性;利用qRT-PCR,对LlWRKY39的表达量进行检测,结果显示在37℃连续热激处理后,LIWRKY39在叶片中的表达呈现上升趋势,表明LlWRKY39的表达受高温诱导;利用hiTAIL-PCR的方法分离克隆LlWRKY39启动子,长度为737 bp,其后利用荧光素酶报告基因检测启动子活性。结果表明,LlWRKY39启动子活性受高温增强。（3）为进一步研究LlWRKY39在热胁迫下的生物学功能,利用花序浸染法异源转化拟南芥。筛选得到三个转基因阳性株系（OE-2、OE-4、OE-5）,并进行基础性耐热和获得性耐热性检测。结果显示在基础性耐热检测中,三个转基因株系（OE-2、OE-4、OE-5）的存活率均显著高于WT,分别比WT高约41.4%、42.6%、49%;在获得性耐热检测中,三个转基因株系分别比WT高约52%、33.9%、35.1%。应用qRT-PCR,对野生型和转基因植株中耐热相关基因进行检测。结果显示,在转基因植株中,AtHSFA1、AtHSFA2、AtMBF1c、AtGolS1、AtDREB2C的表达显著提高。利用农杆菌介导的瞬时转化法,转化百合,热激处理后测定其电导率。结果发现,在热激情况下,百合中瞬时过表达LlWRKY39可显著降低其离子渗透率,提高百合的耐热性。（4）为检测百合中LlWRKY39对LlMBF1c的调控作用,采用农杆菌介导的瞬时转化方法在‘白天堂’叶片中过表达LlWRKY39。结果显示,在百合中过表达LlWRKY39可以激活LlMBF1c的表达;我们同时分离得到了 LlMBF1c启动子序列,其包含有典型的W-box元件;随后采用酵母单杂交和效应子-报告子实验对其可能存在的调控关系进行检测。结果显示,在酵母中,LlWRKY39可直接结合LlMBF1c启动子上的W-box元件;在烟草叶片中,LlWRKY39能够显著激活LlMBF1c启动子的活性,暗示LlWRKY39可能是LlMBF1c的上游调控因子。（5）参考此前WRKY-Ⅱd与CaM的互作研究,选取百合中LlCaM3作为LlWRKY39互作候选蛋白。利用双分子荧光互补实验和荧光素酶互补分析实验检测LlWRKY39与LlCaM3是否互作,实验结果表明,LlWRKY39与LlCaM3存在互作关系。接着利用双荧光素酶报告基因实验,检测LlCaM3与LlWRKY39互作对LlMBF1c启动子活性的影响。结果表明,LlCaM3可通过与LlWRKY39互作来抑制LlMBF1c启动子的活性。
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