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将一株林间释放菌株Bb13以及111株从皖南宣城球孢白僵菌放菌区僵虫、空气和土壤中分离获的球孢白僵菌土著菌株在SDAY上进行配对培养,了解彼此间的营养亲和性。结果表明,112个菌株分属于9个营养亲和群(VCG),VCG01由36个菌株组成,VCG02由23个菌株组成,VCG03含25个菌株,VCG05含16个菌株,VCG13含8个菌株,VCG26、VCG27、VCG28和VCG29均只包含一个菌株。其中111株土著菌株中有35株与Bb13是亲和的,亲和比例为31.53%;有76株与Bb13不亲和,不亲和比例为68.47%。这些结果揭示了马尾松林生态系中球孢白僵菌具高度的种群异质性和丰富的遗传多样性。释放菌株Bb13的13个单孢子株在第一代均是亲和的,继代10代后,有7个子株的营养体亲和性没发生改变,6个菌株发生了改变。由此可见,继代培养会使单孢株的营养亲和发生改变。
对包括上述112个菌株的地理来源不同的245株球孢白僵菌在SDAY培养基上直接配对培养,进行营养亲和分析,结果表明,它们可划分为29个VCG,VCG01由62个菌株组成,VCG02含25个菌株构成,VCG03含23个菌株,VCG04含20个菌株,VCG05所含的16个菌株均采自宣州,VCG06含9个菌株,VCG07、VCG11、VCG12和VCG14都由6个菌株组成,VCG08含9个菌株,VCG09和VCG10都含有7个菌株,VCG13含8个菌株,VCG15、VCG18和VCG19均包含5个菌株,VCG16、VCG17均含4个菌株,VCG20含3个菌株,VCG21由采自岳西的2个菌株组成;VCG22、VCG23、VCG24、VCG25、VCG26、VCG27、VCG28以及VCG29都只由一个菌株构成。各地区都有一个较大的优势VCG群体,占有本地区约三分之一的菌株数。各VCG的菌株按照各自的采集地、不同的分离寄主分别计算,不同的地理来源平均6.03个菌株组成1个VCG,其P及Shannon-Wiener多样性指数分别为0.1659及0.7609;由不同目寄主上分离的菌株平均2.63个菌株形成1个VCG,P及Shannon-Wiener多样性指数分别为0.3800和1.1065。由此可见,相同地理来源的营养亲和型多样性要明显小于相同分离寄主的菌株,来源于同一地区的菌株属于同一VCG的概率要大于相同分离寄主的菌株。
包含地理来源不同的菌株,例如,本试验释放的安徽霍邱Bb13与来自日本的Bb202属于同一个VCG。地理来源相同的菌株分属不同的亲合群,可能与不同菌株营养亲和这一遗传特性的形成受到小范围生态位的微环境的影响有关。
对20个含菌株数较多的VCG进行遗传多样性研究的结果表明,总体看来,各VCG菌株的28SrDNA域的Ⅰ型内含子的单倍型种类多样;另外,在同一VCG中,没有占比例较大的单倍体类型。POPGENE分析结果表明:Neis基因多样性指数最大可达0.4589,最小为0.0326,但结合多态性信息量PIC分析,最大的多态信息量为0.9278,最小的为0.4978。以上结果表明,各VCG菌株的营养亲和遗传型与Ⅰ型内含子的类型没有直接的相关性。
通过筛选硝酸盐营养缺陷(Nit)突变体,利用营养体亲和技术,对6个球孢白僵菌菌株的VCG进行了研究,结果显示6个菌株分属于2个VCG,其中一个VCG由5个菌株组成,另外一个VCG仅由1个菌株组成。通过E23/E24、I21/I22、I31/I32、I38/I29四对引物对6个出发菌株28SrDNAD8-D11域4种不同的内含子的研究,仅筛选出一对引物(I21/I22)扩增出菌株Bb13和Bb192有不同的特征带;在其它位点的内含子均相同。另外,对8个ISSR引物进行筛选,结果显示,有3个引物在5个菌株中共扩增出41条带,其中11条为多态性条带,多态性为26.83%,采用这3条引物扩增结果可明显看到Bb13与其它5个出发菌株间的差异条带。
将采用的Nit技术确定的同一VCG的菌株成对配对接种在马尾松毛虫3龄幼虫活体上3-12d后感染致死的僵虫体表长出白色菌丝。用2对引物I21/I22和I31/I32,对12个分离株的28SrDNAD8-D11域进行扩增,12株用从Bb13和Bb192配接致死的虫尸上分离的分离株用引物I21/I22扩增出的在第二个位点上同时具有Bb13和Bb192两个菌株的特征条带,表明基因重组率高达100%。将12株分离株在人工培养基上继代培养所得的F1代子株采用相同条件的扩增结果显示,12个菌株中,只有4个菌株在第二个位点上保持了异核体;将此四个分离株在人工培养基上继代培养所得的F2代子株继续扩增的结果显示,只有1个菌株仍保持异核体;将这一个F2代子株继续培养所得的F3代子株,用同样引物继续扩增,结果显示其异核体发生了分离。与此同时,第三个位点始终都保持B型。用从Bb13和Bb207配接致死的虫尸上分离的10个分离株用ISSR引物Pri1进行扩增,结果表明仅有2个分离株发生了基因重组,同时具有Bb13和Bb207两菌株的差异条带。