论文部分内容阅读
中国多数胃癌患者在诊断时已属中晚期。全身化疗是晚期胃癌的主要治疗方法。铂类药物为晚期胃癌化疗的基石药物，但由于其耐药性使得化疗疗效不尽人意，目前全身化疗已进入“瓶颈”。DNA修复能力增强是铂类化疗耐药性产生的主要机制之一,涉及到多种信号转导通路和基因。NER是DNA损伤修复的主要途径，此外，ERCC1基因表达产物是NER通路中的限速酶。部分研究发现检测患者肿瘤组织中铂类相关核苷酸切除修复交叉互补组1（ERCC1）的基因表达水平，可预测铂类化疗药物的疗效。但也有研究报道：根据ERCC1的表达选择敏感的化疗药物进行治疗，疗效及生存期提高并不明显，说明ERCC1的表达水平可能无法涵盖铂类耐药的全部机制。根据Pubmed数据库所提供的在ERCC1启动子区发现了两个低氧诱导因子（HIFs）家族的结合位点，推测ERCC1为下游基因，可能其上位调控点是否与HIFs有关联。肿瘤的恶性增殖易导致肿瘤微环境内缺氧，HIF-1α表达上调，造成基因不稳定性，增强肿瘤细胞对细胞毒性药物的耐受力。HIF-2α也被认为与胃癌细胞的增殖、侵袭、转移相关。但HIF-2α、ERCC1的过表达与铂类药物耐药是否有关尚不清楚。已显示藏红花素不仅具有抗肿瘤增殖作用，还有抗缺氧作用。本课题拟探讨Crocin是否能逆转肿瘤微环境缺氧，通过调节HIF-2α、ERCC1，改变胃癌细胞株对DDP的敏感性。此外，生物信息学研究显示，微小核苷酸(MicroRNAs，miRNAs)可通过调节不同的基因而发挥重要的生物学效应。miRNAs的变化还能够通过调控不同的靶点而影响其靶蛋白功能，从而改变肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。研究已证实低氧能够影响部分miRNAs的表达，而且肿瘤细胞在低氧环境下，HIFs稳定表达可诱导某些miRNAs的表达上调，抑制其DNA修复功能，从而可以影响化疗敏感性。本研究分为三个部分： 第一部分：藏红花素联合顺铂对胃癌BGC-823细胞的抗肿瘤机制。 目的：探讨藏红花素联合顺铂在常氧、低氧下对胃癌BGC-823细胞的影响及作用机制。 方法：BGC-823细胞分组：对照组（不加药物组，NC），C1组（予以0.8μg/mL DDP组），C2组（予以1.6μg/mL DDP组），Z1组（予以8 mg/mL Crocin组），Z2组（予以16 mg/mL Crocin组），C1+Z1组（予以0.8μg/mL DDP联合8 mg/mL Crocin组），C1+Z2组（予以0.8μg/mL DDP联合16 mg/mL Crocin组），C2+Z1组（予以1.6μg/mL DDP联合8 mg/mL Crocin B组），C2+Z2组（予以1.6μg/mL DDP联合16 mg/mL Crocin组）。细胞经不同时间及低氧状态处理后，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）分析抗增殖效应，流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡变化，采用实时定量反转录聚合酶链反应（real-timequantitative reverse transcription polymerase chain reaction，real-time qRT-PCR)测定P53、Bax、Bcl-2、HIF-2α及ERCC1 mRNA的表达变化，蛋白免疫印迹法（Western-Blotting）检测Caspase-3蛋白表达变化。 结果：⑴5％低氧48h胃癌 BGC-823细胞生长抑制明显，明显低于常氧对照组（P<0.05）。⑵常氧下处理DDP48 h，IC50为1.634μg/mL，DDP（0.8μg/mL、1.6μg/mL）48 h处理后胃癌BGC-823细胞抑制明显，5％低氧下，DDP48 h对细胞抑制作用较常氧下降（P<0.05）。⑶常氧下32 mg/mL Crocin对BGC-823细胞显示出致死量，48h后，IC50值为28.129 mg/mL，故以8、16 mg/mL Crocin48 h为后续培养条件，而5％低氧下，16 mg/mL Crocin对细胞的抑制作用不明显，甚至高于低氧对照组（P<0.05）。⑷常氧下，Crocin联合DDP较单用Crocin或DDP48 h对BGC-823细胞增殖抑制作用增强，其中Crocin（16 mg/mL）联合DDP（1.6μg/mL）抑制作用最强（P<0.05），而在5％低氧条件下，Crocin联合DDP与单用DDP相比对细胞增殖抑制作用下降，相同浓度 Crocin联合DDP对细胞增殖抑制作用低于常氧下（P<0.05）。⑸常氧下，Crocin联合DDP对 BGC-823细胞促凋亡作用高于单用DDP及Crocin（P<0.05）。⑹常氧下，Crocin联合DDP诱导p53和Bax mRNA表达水平与对照比较上调（P<0.05），Bc1-2/Bax比值明显下降。⑺常氧下，Crocin联合DDP与单用DDP、Crocin比较活化Caspase-3表达量明显增加（P<0.05）。⑻常氧下，Crocin联合DDP引起HIF-2α、ERCC1mRNA表达水平较对照组、单药组升高。 结论：①低氧下，胃癌 BGC-823细胞生长抑制明显，低氧增加 BGC-823细胞对DDP的耐药性，而低氧下Crocin对BGC-823细胞的抑制不明显，是否克服了低氧对BGC-823细胞抑制作用有关，需进一步证实。②常氧下，Crocin联合DDP对BGC-823细胞增殖抑制作用增强，而低氧下，联合用药对细胞的抑制作用低于单用DDP及其在常氧下。③常氧下，Crocin联合DDP诱导p53和Bax mRNA表达水平上调， Bc1-2/Bax比值下降，促进Caspase-3活化，考虑Crocin联合DDP作用机制与凋亡通路相关。低氧下，联合用药对细胞的影响的机制需进一步探讨。④常氧下，Crocin联合DDP细胞HIF-2α和ERCC1mRNA表达水平并无下降，甚至上升，考虑低氧通路及DNA修复通路不是Crocin联合DDP抗细胞增殖、促凋亡的主要作用机制，但Crocin联合DDP与低氧通路、DNA修复通路及凋亡通路相关的研究，仍需进一步研究。 第二部分：HIF-2α对胃癌BGC823细胞ERCC1基因调控的研究。 目的：研究HIF-2α基因表达变化及对胃癌 BGC-823细胞 ERCC1基因表达的影响，以明确HIF-2α是否与ERCC1基因调控顺铂的耐药。 方法：⑴以人HIF-2α基因为模板，突变两个氨基酸位点（P531A&P405A）为HIF-2α突变体（HIF-2α-dPA），而后获得HIF-2α-dPA慢病毒表达载体重组质粒。通过慢病毒感染，建立稳定表达 HIF-2α蛋白的人胃癌 BGC-823细胞系，采用real-timeqRT-PCR、Western-Blotting检测HIF-2α和ERCC1 mRNA及蛋白的表达。⑵根据人的ERCC1基因启动子序列设计引物，扩增人基因组DNA中的ERCC1启动子，将ERCC1基因启动子插入到双酶切pGL3-Basic报告载体后，获得 pGL3-Basic-ERCC1-promoter载体重组质粒。重组质粒pGL3-Basic-ERCC1-promoter转染不同组BGC-823细胞，24 h后，通过Luciferase检测ERCC1启动子活性。 结果：①通过建立HIF-2α蛋白稳定表达的人体胃癌BGC-823细胞系（HIF-2α-dPA BGC-823稳定株），HIF-2α-dPA BGC-823稳定株与未处理的BGC-823细胞相比， HIF-2α mRNA和蛋白表达上调（P<0.05），而ERCC1 mRNA及蛋白表达没有明显的上调（P>0.05）。②通过构建了pGL3-basic-ERCC1-promoter报告基因载体重组质粒。质粒转染到BGC-823细胞及HIF-2α-Dpa BGC-823稳定株后，两组ERCC1启动子活性明显高于对照组（P<0.05），HIF-2α-Dpa BGC-823稳定株相对未经处理的BGC-823细胞的ERCC1启动子活性没有明显增加（P>0.05）。 结论：⑴通过构建HIF-2α突变体（HIF-2α-dPA）慢病毒表达载体，表明HIF-2α的高表达的胃癌BGC-823细胞没有促进ERCC1表达的显著变化。⑵通过构建 pGL3-basic-ERCC1-promoter报告基因载体，表明 HIF-2α的过表达BGC-823细胞没有引起ERCC1的荧光值的显著增加。因此，HIF-2α是否调控ERCC1基因的表达，仍需进一步深入探讨。 第三部分：不同海拔藏族胃癌microRNAs的初步筛选。 目的：筛选不同海拔藏族胃癌患者的miRNAs差异表达，预测不同海拔藏族胃癌患者潜在的治疗靶点，研究低氧在胃癌发生发展中的作用机制。 方法：收集13例初治藏族胃癌患者，其中长期居住在2260米以下5例，居住在3000米以上8例，采用Affymetrix GeneChip miRNA3.0进行组织芯片检测。10例藏族胃癌和癌旁配对组织使用limma package分析miRNAs差异表达，使用MultiMiR package预测miRNA-靶基因；对5对不同海拔癌组织使用SAM法分析miRNAs差异表达，用miRWalk网站查询已证实的靶基因。使用DAVID数据库，进行功能富集分析。 结果：⑴10例藏族胃癌microRNAs的初步筛选结果：共筛选出27个差异表达的miRNAs，包括25个低表达和2个高表达，其中 has-miR-148a-3p， has-miR-148b-3p，has-miR-363-3p为调控最多的靶基因，并且三者的靶基因大量重叠，包括 Wnt1， KLF4，S1PR1，CAND1， CNTN4等，均明显富集到与癌症相关的Wnt，MAPK和Jak-STAT信号通路上。⑵不同海拔藏族胃癌microRNAs的初步筛选结果：共筛选出16个差异表达的miRNAs，其在3100米以上海拔胃癌组织中表达上调，仅有hsa-miR-1260b、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-3648、hsa-miR-4284查询到已验证的靶基因，其中hsa-miR-1260b和 hsa-miR-130b-3p调控多个靶基因，如 E2F1， CDKN1A， HSP90B1，CDKN1B，PPARG，TGFBR2，EGLN3，SMAD4等基因，都富集到癌症通路上。 结论：①has-miR-148a-3p，has-miR-148b-3p和has-miR-363-3p在藏族胃癌组织中下调，且其靶基因富集到癌症通路上，这三个miRNAs可能参与了藏族胃癌的发生、发展，但需进一步功能研究。②hsa-miR-1260b和hsa-miR-130b-3p在高海拔藏族胃癌中上调，且其靶基因富集到癌症通路上，这2个miRNAs可能为高原藏族胃癌下一步功能验证提供理论依据。