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背景和目的:中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一,尤其适合需要复杂翻译后修饰的分子类型,例如需糖基化的细胞因子、各类全长单克隆抗体等。然而,与大肠杆菌、酵母等表达系统相比,以CHO细胞为代表的哺乳动物细胞表达系统的培养成本较高,导致产品价格昂贵、病人难以负担。因此,提高CHO工程细胞株的生长性能及外源蛋白表达能力,对降低药物成本、进而提高市场可及性具有重要意义。以往研究证实,培养基和培养条件优化、筛选外源基因整合位点等方式能够有效提高CHO的生长及表达水平,而近年来,随着高通量测序、高效基因编辑等新兴技术等的涌现,使得功能基因筛选及CHO细胞的精确基因编辑成为可能。本实验室前期进行了CHO细胞的DNA甲基转移酶3A（DNMT3a）敲除,在此基础上通过RNA-seq发现转录激活因子3（ATF3）基因受DNMT3a敲除的影响出现转录水平上调,可能与CHO细胞的生长、代谢及表达水平的变化相关。另一方面,本实验室采用规律成簇的间隔短回文重复/规律成簇的间隔短回文重复结合蛋白9（CRISPR/Cas9）建立了CHO细胞的基因敲除及外源基因整合技术,并筛选到C12orf35、HPRT等稳定性较好的外源基因整合位点,可用于基因定点整合的稳定细胞株建立。本研究中,我们结合前期研究及文献检索,选取具有细胞生长代谢调节功能的ATF3及酪蛋白激酶Ⅱ的α亚基（CK2α）两个基因,深入研究其过表达对CHO细胞的作用。方法:为了探究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞增殖和外源蛋白表达的作用,首先我们构建了瞬时表达ATF3和CK2α的质粒,并将这两种质粒各自转染到红色荧光蛋白（mCherry）稳定表达的CHO细胞株KCSG6中,通过转染后1～5天细胞计数、培养结束时m Cherry蛋白的表达水平检测,来初步评价ATF3和CK2α基因过表达对CHO细胞生长及蛋白表达的影响。为了更严谨地研究ATF3和CK2α两个基因的功能,我们采用CRISPR/Cas9介导的稳定细胞株构建技术,选取HPRT作为整合位点,选取向导RNA（sgRNA）序列,并设计和构建定点整合的Donor质粒ATF3-Donor、CK2α-Donor和ATF3+CK2α-Donor。在KCSG6细胞株上通过电转染、加压筛选以及5’/3’junction PCR的鉴定,获得相应的稳转细胞池,并通过有限稀释法铺板,对得到的单克隆细胞进行5’/3’junction PCR和OUT-OUT PCR的鉴定和测序等鉴定,挑选KCSG6细胞株背景下的ATF3、CK2α以及ATF3+CK2α过表达的细胞株。通过对所筛选到的稳定细胞株进行插入基因表达验证、生长特性以及模式蛋白表达水平检测,并进一步探究插入基因对CHO细胞凋亡和相关信号通路的影响,系统地研究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞的作用和机制。结果:通过瞬时转染ATF3和CK2α质粒进入KCSG6细胞,我们发现ATF3和CK2α对细胞增殖及蛋白表达均具有促进趋势。经过CRISPR/Cas9基因编辑技术将ATF3基因、CK2α基因以及ATF3+CK2α基因成功插入KCSG6细胞株的HPRT位点,最终成功得到3株稳转细胞株:ATF3-8、CK2α-3、AC-2。通过对这三株细胞进行相关性质的探究,证明目的基因定点整合到HPRT位点,并得到成功表达,且ATF3和CK2α对CHO细胞增殖具有促进作用,CK2α对mCherry总蛋白的产量具有促进作用。通过对比这3株细胞株与对照细胞株的细胞凋亡,我们发现AC-2细胞株的ATF3+CK2α过表达具有抑制细胞凋亡的作用,而单独的ATF3或CK2α基因无明显作用;通过对这3株细胞株的信号通路进行初步探究,发现相对于空白细胞,这3株细胞的ERK信号通路水平上调。其中,对DNMT3a敲除的CHO细胞进一步研究发现,ATF3基因的启动子区胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）甲基化水平受DNMT3a调控,这对理解ATF3的调控机制具有一定的启示。综上,本研究证实ATF3基因以及CK2α基因过表达对CHO细胞增殖具有促进作用且CK2α对于细胞总蛋白表达具有促进作用,提示该细胞改造策略具有重要意义。本研究中我们还获得了ATF3及CK2α基因过表达的CHO稳定细胞株,可结合细胞培养工艺优化等进行更深入的研究,不断提高CHO细胞培养和蛋白生产水平。