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研究背景：众所周知,高血糖是导致糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease, DKD)的始动因素,因此探讨高糖对肾脏的影响及其作用机制成为早期防治DKD研究的必然环节。关于高血糖对肾脏的影响及相关机制的动物实验研究已不胜枚举,但高糖对人体肾脏组织细胞的具体危害及其具体作用机制尚待进一步明确,因此这方面的研究成了本领域的研究热点。尤其是高糖通过各种细胞因子、各种信号途径对肾脏固有细胞如系膜细胞、足细胞、内皮细胞及肾小管上皮细胞的影响等方面的研究越来越多,越来越深入。高糖对肾脏结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)的表达的影响和相应机制研究正是目前研究的热点之一。系膜细胞具有重要的生理功能：是肾小球毛细血管丛的主要支架,具有收缩、分泌功能,可以通过其系膜细胞膜上的血管活性物质受体,根据机体需要调节收缩从而改变肾脏滤过膜的滤过面积；系膜细胞还具有很强的吞噬能力,对清除肾小球滤过的某些大分子物质起着重要作用。众所周知,高血糖是DKD发生始动因素和核心因素,而系膜细胞的上述生理学特性决定了它是糖尿病众多致病因子作用的主要靶细胞之一。然而,人类肾小球系膜细胞的原代培养一直存在不少困难,诸如：培养细胞的成功率低、生存时间较短,传代困难或传代次数太少等问题,从而阻碍了针对人肾小球系膜细胞的实验研究的开展,极大地影响了肾小球相关疾病研究的进展。CTGF作为一种富含半胱氨酸的分泌型蛋白,具有很强的促纤维化效应。目前已知,CTGF的主要作用机理是通过自分泌、旁分泌等方式来诱导多种细胞的分化、增殖,并且参与介导这些细胞的迁移、黏附、聚集,促进组织细胞外基质的合成和沉积,从而导致相应靶器官的纤维化。另外,已证实CTGF还具有诱导血管生成、参与组织细胞的创伤修复以及诱导细胞凋亡等一系列生物学功能。CTGF在人体多种组织器官中广泛存在,它作为一种重要的细胞因子参与了细胞外基质合成和沉积,而后者正是组织纤维化的一个重要机制。研究发现肾脏是人体众多组织器官中含有CTGF最多的器官之一,肾脏的多种固有细胞均可表达CTGF,并在某些因素如氧化应激、缺氧高糖等作用下出现高表达。已有实验证实,CTGF可通过介导糖基化终末产物这一经典途径促进肾脏系膜细胞合成胶原蛋白和纤维黏连蛋白,从而参与了肾脏纤维化的进展。新近研究不仅在DKD动物模型的肾脏组织中发现了CTGF的高表达,而且在DKD患者肾脏组织中也有类似的发现,因此认为CTGF作为一种非常重要的促纤维化因子在DKD的发生、发展中发挥着重要作用。本课题组近年的研究显示,在糖尿病大鼠肾脏病变早期就已经开始出现肾组织中CTGF的高表达以及血、尿CTGF浓度的增加,而且血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂厄贝沙坦可通过降低血CTGF水平来减轻糖尿病大鼠肾脏损伤。另外也有学者检测到1型糖尿病患者血浆中CTGF水平升高,并且这种变化甚至在微量白蛋白尿出现之前就已经发生,而且其水平的变化与患者的蛋白尿水平和肾功能(内生肌酐清除率)有着很高的相关性。以上研究均提示CTGF与DKD的发生发展密切相关。因此,该因子今后极有可能成为早期诊治DKD以及判断预后的重要指标。但是上述血和尿中CTGF水平升高的具体来源以及其表达增加的病理生理意义到目前还不十分清楚。据已有的文献报道,CTGF可通过某种机制诱导体外培养的肾脏系膜细胞和足细胞发生增生、肥大,而系膜细胞肥大是DKD早期肾组织的主要病理特征之一。目的：1.培养重复性好、可多次传代的人肾小球系膜细胞(HMC)2、探讨高糖环境对体外培养的人肾小球系膜细胞(HMC)表达结缔组织生长因子(CTGF)及其受体-低密度脂蛋白受体相关蛋白(loWdensity lipoprotein receptor-related protein,LRP)的影响以及相应的信号机制。研究方法：1.体外HMC培养：取成人肾脏肿瘤术后相对远离肿瘤的肾组织、水囊引产的胎儿肾脏组织,通过3层筛网滤过分离,选取最下层筛网上肾组织,采用胶原酶消化后,培养正常人肾小球系膜细胞,用系统性观察和免疫荧光检查等方法进行鉴定后传代培养。2.高糖刺激实验：以体外培养的HMC为研究对象,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ABC-ELISA)测定正常糖组(NG组)、高糖组(HG组)和甘露醇组(MG组)培养液中CTGF、磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase,pERK)及LPR的浓度变化,分别观察高糖环境对系膜细胞CTGF蛋白表达、丝裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信号通路的活化以及CTGF受体LRP表达的影响。结果；1.经形态学、免疫荧光检查等方法鉴定证实培养细胞是肾小球系膜细胞,成人肾脏原代培养2周后才可传代,胎儿肾系膜细胞原代培养1周即可传代,且可连续培养至第7代以上。2.HMC本身存在基础水平的CTGF蛋白表达,在高糖环境中培养1d后,CTGF蛋白表达升高,峰值出现在第3d,自第4d开始下降；而对照组CTGF蛋白表达未随时间发生显著变化；高糖环境下HMC外信号调节激酶(ERK)出现动态活化：1h即开始检测到pERK升高,峰值出现在第8至24h,于48h内降至基础水平,而对照组在各时点均未能检测到pERK表达；加入PD98059(ERK活化特异抑制剂)后发现高糖环境对HMC表达CTGF蛋白增加的影响被抵消；另外,高糖环境未影响LRP的表达。结论：1.利用3层滤网分离人肾小球系膜细胞法简便高效,所培养的原代肾小球系膜细胞符合人肾小球系膜细胞的生物学特性。2.进一步证实胚胎肾组织比成人肾组织原代细胞培养易于成功。3.高糖环境下HMC表达CTGF蛋白增加,但未增加CTGF受体LRP的表达,初步明确CTGF的高表达是通过磷酸化激活ERK实现的。