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Restin是本实验室从全反式维甲酸诱导的HL-60细胞中克隆得到的黑色素瘤相关抗原(melanomaassociatedantigen,MAGE)新基因，GenBank确认号为NM_014061。该基因定位于人类染色体Xp11.21，全长1475bp，含一个开放读码框，编码219个氨基酸，蛋白质分子量约为24.4kD，等电点为9.05。Restin蛋白N末端8-25位氨基酸为一非典型二分裂核定位信号序列；88-176位氨基酸为黑色素瘤相关抗原同源结构域(melanomahomologousdomain,MHD)。生物信息学分析显示，Restin与MAGE家族Ⅱ类分子MAGED、Necdin高度同源。 组织表达谱分析表明，Restin表达于生殖细胞和终末分化细胞，在脑、神经、前列腺组织中高表达，在肿瘤组织中不表达或低表达。Restin启动子分析发现其5’端上游2kB基因组序列中存在一个p53蛋白结合位点，但不存在直接相互作用，Restin基因的转录间接受p53调控。此外，Restin启动子区还存在STAT-1a结合位点，STAT-1a在ATRA诱导的细胞中上调Restin的表达。 文献报道和Restin相互作用分子有p75NTR、CDK5RAP2、KPNA2、MOAP1、PIAS4、TADA3L、NAP1L5。本课题组前期实验发现Restin与ATF3也存在相互作用。TeherPakov等证实Restin和Necdin都可以与p75NTR胞内段直接相互作用，一起参与p75NTR信号通路，调节神经细胞的分化。Salehi等发现Restin的同源分子MAGED1也与p75NTR存在相互作用，诱导神经生长因子依赖的凋亡发生。p75NTR在不同生理环境下产生诱导细胞的存活和增殖、凋亡、细胞周期、神经迁移和形态生成等生物学效应。在乳腺癌细胞系MCF-7中的过表达Restin可出现细胞周期阻滞，推测可能与p75NTR信号通路有关。Restin作为p75NTR信号通路的下游分子，其具体作用机制仍不清楚。 Restin蛋白为核蛋白，而细胞信号转导途径最终的效应分子转录因子在核内调节基因转录，因此筛选与Restin相互作用的转录因子是非常有意义的。双杂交技术是研究蛋白质间的相互作用的一种常用技术，哺乳动物细胞双杂交系统具有假阳性率低、灵敏度高等优点。本课题组先前利用哺乳动物细胞双杂交系统构建了真核细胞信号转导蛋白文库。本研究中，我们利用该文库中的转录因子子文库筛选与Restin相互作用的转录因子，筛选了包括参与细胞周期调控、应激反应、蛋白质修饰等方面的55种转录因子。 实验结果发现，ZNF238、ZNF239、ZNF486与Restin存在相互作用，并且在低温刺激的培养条件下结果更明显。ZNF238、ZNF239、ZNF486是三个具有锌指结构的蛋白。锌指蛋白功能广泛，参于胚胎发育、性别确定、激素分泌、细胞的分化、衰老和凋亡，并与许多疾病的病理过程相关。先前研究认为，ZNF238在大脑皮质的发育中对神经元的增殖、分化、迁移起重要作用。ZNF239与laminA/C和核基质结合发挥转录抑制作用。ZNF496的生物学功能尚未见报道。 另外，利用蛋白质相互作用数据库查询Restin的相互作用蛋白。结果显示已知相互作用蛋白CDK5RAP2、KPNA2、MOAP1、PIAS4、TADA3L、NAP1L5是通过酵母双杂交芯片检测所得。我们期望利用哺乳动物细胞双杂交系统做进一步验证，于是克隆构建了pACT-TADA3L、pACT-KPNA2双杂交质粒，观察Restin与TADA3L、KPNA2结合情况，进一步证实了Restin与TADA3L、KPNA2存在相互作用。 研究未知基因的功能，获得有活性的蛋白是至关重要的。本研究中，还利用大肠杆菌原核表达系统对Restin进行了克隆表达。利用分子克隆技术，分别构建了含不同融合标签的pET41a(+)-Restin，pET44a(+)-Restin重组载体。鉴于Restin编码区含有大肠杆菌稀有密码子，选择了能够补充大肠杆菌7种稀有密码子tRNA的宿主菌Rosetta-gamiTM2(DE3)进行转化，提高了外源基因在原核系统中的表达水平，重组载体获得了可溶性表达。 综上所述，我们筛选出与Restin存在相互作用三个转录因子ZNF238、ZNF239和ZNF486，并进一步证实了TADA3L、KPNA2存在相互作用。通过对原核表达系统质粒载体和宿主菌的优化，实现了Restin融合蛋白的可溶性表达，为进一步研究Restin的生物学功能奠定了基础。