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心肌梗死后机体长时间处于神经内分泌激活状态,从而引起靶器官、组织和细胞的一系列改变,左心室心肌发生重塑(LVRM),LVRM不仅影响急性期心功能状态,而且是决定急性心肌梗死后心脏事件发生和远期预后的主要因素,独立地影响心衰的进程和病人的预后。因此,心衰过程是否可以逆转取决于发生在心肌细胞水平、心肌组织水平及左侧心室结构水平的改变是否可逆。随着研究进展,梗死后心脏所经历的心室重塑进程受到被激活的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和交感肾上腺素能神经系统及其相互作用的影响,这已得到了共识。大型临床试验和动物实验研究结果表明,β-受体阻滞剂和血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-I)均有改善心室重构和抑制心肌纤维化的作用,两种干预措施合用效果更佳,可能与同时阻断AMI后过度激活的交感神经系统和RAAS有关。但ACE-I治疗心力衰竭所出现的“醛固酮逃逸”现象,表明了ACE-I治疗的局限性,醛固酮(Aldo)对于心血管的不利作用包括促进心肌纤维化、LVRM、左室肥大、充血性心力衰竭、高血压等逐渐被认识,而醛固酮受体拮抗剂的心血管保护作用也已受到更多的关注。RALES和EPHESUS研究已证实了醛固酮受体拮抗剂治疗轻、中和重度充血性心力衰竭的有效性和安全性,显示螺内酯联合ACE-I在心力衰竭治疗中的良好作用,醛固酮受体拮抗剂可延缓LVRM进程,将会使慢性心力衰竭和/或AMI后心衰患者显著获益。那麽,急性心肌梗死而无严重心功能障碍的患者是否能从中获益?早期进行醛固酮受体拮抗剂—螺内脂干预对AMI后左室重构改善的远期效果还有很多值得深入探讨之处,我们在这方面已经积累了很多好的临床经验是进行深入探索的基础。我们前期的临床研究和基础研究结果显示:在急性心肌梗死而无严重心功能障碍的患者中联合应用醛固酮受体拮抗剂和ACE-I可抑制左心室的扩张和心肌纤维化,从而改善左心室功能;螺内酯联合使用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可以减少左室重量指数,改善左室收缩与舒张功能,阻抑心肌胶原沉积并降低Ⅰ/Ⅲ型胶原比值,其作用可发生在胶原基因水平,有效地阻抑心肌梗死后左室重构,两种药物合用可产生明显的叠加效应,优于任何一种单用。本课题通过模拟急性心肌梗死病理生理机制,探索制作出心肌坏死面积理想而稳定的动物模型,此模型具有透壁心肌损伤坏死、固定并足够大的损伤坏死面积,并有较低动物死亡率的特点;本课题通过使用无呼吸机支持、短时间、反复三次超低温冷冻左室游离壁15秒的方法,建立大鼠稳定的心肌冷冻损伤坏死、具有轻、中度心衰(损伤面积20%-40%)模型,在此模型的基础上,进一步探讨螺内酯、ACE抑制剂、β-受体阻滞剂早期联合长时间干预对大鼠心肌冷冻损伤坏死后心肌晚期重构和心肌细胞凋亡的影响,为急性心肌梗死伴轻、中度心力衰竭的治疗提供新的思路与方法。本研究的实验动物为健康Wistar大鼠135只,体重200-220克,性别按各部分试验要求所定,购自河北医科大学实验动物中心,检疫合格。本课题研究共分三部分。第一部分:无呼吸机支持、短时间、反复冷冻法建立大鼠急性心肌坏死模型方法研究目的探讨建立无呼吸机支持、短时间、反复冷冻法制作大鼠急性心肌坏死模型方法。方法与结果1.方法将60只Wistar大鼠(雄性/雌性各半),按照总共冷冻损伤时间随机分三组:15秒组(5秒/次,共3次);25秒组(5秒/次,共5次);40秒组(5秒/次,共8次)各20只。胸骨左缘前外侧第四肋间进入胸腔充分暴露心脏,用浸入液氮内之直径6mm铜质金属棒充分接触左室游离壁,持续时间5秒/次,随即闭合胸腔,待自主呼吸恢复正常后,按分组情况再次原位反复3次、5次或8次进行心肌冷冻损伤。观察术中、术后28d.内大鼠存活率以及术后28d.行心脏病理切片、Masson染色计算坏死面积。2.结果①三组模型病理学检测均达到心肌损伤坏死面积超过20%、透壁心肌损伤坏死、坏死完全且边界清楚。②15秒组存活率较40秒组高(16/20 versus 5/20, p<0.0167),但其梗死面积较40秒组坏死面积小((28.28±5.19)% versus(37.77±10.57)%, p<0.05)。③25秒组存活率和坏死面积与其他两组分别比较无明显差异(9/20 versus 16/20, p>0.0167; 9/20 versus 5/20, p>0.0167) ;(31.38±6.50)% versus (28.28±5.19)%, p>0.05; (31.38±6.50)% versus(37.77±10.56)%, p>0.05)。④40秒组坏死面积变化范围(标准差:10.57%)较其他两组(标准差:5.20%,6.50%)大,且存活率较低。25秒组较15秒组操作繁锁且死亡有增多趋势。小结无呼吸机支持、短时间、反复三次超低温冷冻左室游离壁15秒,可以建立大鼠稳定的急性心肌坏死、模拟心肌梗死伴轻、中度心力衰竭(见后)的模型。第二部分:螺内酯联合ACE抑制剂、β-受体阻滞剂长时间干预对大鼠心肌损伤后心肌重构的影响目的探讨螺内酯、ACE抑制剂、β-受体阻滞剂联合长时间干预对大鼠心肌冷冻损伤坏死后心肌晚期重构的影响。方法与结果1.方法本研究以液氮心肌左室局部冷冻损伤坏死方法建立大鼠轻、中度心衰(损伤坏死面积20%-40%)模型,具体同第一部分。将制模成功麻醉苏醒后的48只大鼠按随机数字表法分为三组:①AMI(Acute myocardial injury, n=16) ;②AMI+capt.+carv. (AMI+captopril+carvedilo, n=16) ;③AMI+ combination (AMI+carvedilol+captopril+Spironolactone , n=16)。另有④Sham-operated(假手术组,n=12)。制模成功大鼠麻醉苏醒后,按试验设计立即给予相应的干预措施:Spironolactone (20mg·kg-1·d-1), Carvedilol (5mg·kg-1·d-1),captopril (25mg·kg-1·d-1)或等量自来水。以上4组大鼠分笼饲养14w..。最终资料完整大鼠数量为AMI:n=12; AMI+capt.+carv.:n=13; AMI+combination:n=13;Sham-operated:n=12。病理检测并测算心肌损伤坏死面积、血流动力学参数(导管法)等各项指标。2.结果①对心肌损伤坏死术后螺内酯等药物干预14w.心肌损伤和假手术四组大鼠存活率进行比较,各组间的存活率无明显差异(12/16 versus 13/16 or 13/16 or 12/12,P=0.348);对心肌损伤坏死三组存活率比较,各组间的生存率无明显差异(12/16 versus 13/16 or 13/16,P=0.881)。②对坏死面积影响:与AMI相比,AMI+capt.+carv.或AMI+combination之损伤坏死面积较小((33.76±6.37)% or(28.01±6.56)% versus(39.79±6.64)%,p<0.05);与AMI+ capt.+carv.相比,AMI+combination较之损伤面积较小((28.01±6.56)% versus(33.76±6.37)% ,p<0.05),也就是说AMI+combination损伤坏死面积最小。③对主动脉内压力及心率影响:心肌损伤三组和假手术组四组间主动脉收缩压(p=0.1766)、主动脉舒张压(p=0.5529)、主动脉平均动脉压(p=0.2136)及心率(p=0.1115)均无统计学差异。④对左室收缩功能影响:⑴左室收缩压: AMI+combination之左室收缩压较AMI或AMI+capt.+carv.明显增高(121.55±12.48mmHg versus 102.63±19.34mmHg or 105.89±14.08 mmHg ,p<0.05),但与sham-operated比较,无明显差异(121.5±12.48mmHg versus 132.97±11.72mmHg, p>0.05);⑵左室内压最大上升速率:与sham-operated相比,心肌损伤三组较低(5696.48±1425.03mmHg/min or 6358.04±1410.33mmHg/min or 6500.18±1102.4mmHg/min versus 9235.44±1490.73mmHg/min,p<0.05),而心肌损伤三组之间无明显差异(p>0.05)。⑤对左室舒张功能影响:⑴左室舒张末压:与AMI比较,AMI+ capt. +carv.或AMI+combination之左室舒张末压较低(5.24±5.78mmHg or 5.44±8.99 mmHg versus 11.95±6.7mmHg,p<0.05),sham-operated、AMI+capt.+carv.和AMI+combination三组之间比较无明显差异(p>0.05);⑵左室内压最大下降速率:与sham-operated比较,AMI+combination较低(5021.57±1141.26mmHg versus 6062.95±1261.65 mmHg,p<0.05),但较AMI或AMI+capt.+carv.高(5021.57±1141.26mmHg versus 4005.62±1427.84mmHg or 3760.97±974.64mmHg,p<0.05),进一步AMI与AMI+capt.+carv.比较,二者无明显差异(3760.97±974.64mmHg versus 4005.62±1427.84mmHg p>0.05),表明AMI+combination组舒张功能有所改善;⑶等容相左室压力下降时间常数:与sham-operated比较,AMI+combination无明显差异(13.46±4.48 ms versus 13.48±2.98ms,p>0.05),但较AMI或AMI+carv.+capt.明显较长(13.46±4.48ms versus 9.00±2.54ms or 10.97±3.42ms,p<0.05),表明AMI+ combination舒张功能有所改善;⑥心率与左室功能相关性分析:心率与左室舒张末压呈正相关(n=50,r=0.30,p=0.0357),直线回归方程为LVEDP=-10.06+0.04HR。心率与左室收缩压(p=1.1167)、左室内压最大下降速率(p=0.1366)及等容相左室压力下降时间常数(p=0.9710)无明显相关。⑦损伤坏死面积与左室功能相关性分析:损伤坏死面积与左室收缩压呈负相关(n=38, r=-0.45, p=0.0044),直线回归方程为LVSP=152.34-1.33SIZE;损伤坏死面积与-dp/dt呈负相关(n=38,r=-0.49,p=0.0017),直线回归方程: -dp/dt=6930.1-79.02SIZE;损伤坏死面积与τ值呈负相关(n=38,r=-0.41, p=0.0113),直线回归方程:τ=17.55-0.20SIZE;心肌损伤坏死面积与左室舒张末压无明显相关(n=38,p=0.7440)。小结1.急性损伤坏死后早期应用卡托普利、卡维地洛能够缩小大鼠14w.心肌冷冻损伤面积,联合使用螺内酯能进一步缩小损伤面积。2.卡托普利、卡维地洛干预大鼠心肌冷冻损伤坏死14w.可显著改善左室收缩及舒张功能,与螺内酯联合使用可进一步改善左室收缩及舒张功能,它与左室损伤面积缩小和心率减慢密切相关。第三部分:螺内酯联合A CE抑制剂、β-受体阻滞剂长时间干预对大鼠心肌损伤后心肌细胞凋亡影响目的探讨螺内酯、ACE抑制剂、β-受体阻滞剂联合长时间干预对大鼠心肌冷冻损伤后心肌细胞凋亡的影响。方法与结果1.方法本研究使用液氮局部冷冻损伤左室心肌的方法,建立大鼠轻、中度心衰(损伤面积20%-40%)模型,具体同第一部分。将制模成功麻醉苏醒后48只大鼠按随机数字表法分为三组:①A MI (Acute myocardial injury, n=16) ;②A MI+capt.+carv. (AMI+captopril+carvedilo, n=16) ;③AMI+ combination (AMI+carvedilol+captopril+Spironolactone, n=16)。另有④S ham-operated(假手术组, n=12)。制模成功大鼠麻醉苏醒后,按试验设计立即给予相应的干预措施: Spironolactone(20mg·kg-1·d-1), Carvedilol (5mg·kg-1·d-1),captopril (25mg·kg-1·d-1)或等量自来水。以上4组大鼠分笼饲养14w.。最终资料完整大鼠数量为AMI:n=12; AMI+capt.+carv.:n=13;AMI+ combination:n=13;Sham-operated: n=12。使用流式细胞仪,检测干预14w.后损伤坏死瘢痕边缘区域心肌细胞凋亡率,以及电镜下观察凋亡心肌细胞超微结构。2.结果①四组瘢痕边缘区域心肌细胞凋亡率:与AMI相比,AMI+capt. +carv.或AMI+combination之凋亡率较低((13.68±1.86)% or (10.26±2.46)% versus (16.22±3.07)%,p<0.05);与AMI+capt.+carv.相比,AMI+combination之凋亡率较低((10.26±2.46)% versus(13.68±1.86)%,p<0.05);四组比较,Sham-operated之凋亡率最低(5.07±2.27%, p<0.05)。②心肌细胞凋亡率与左室损伤坏死面积呈正相关(n=38, r=0.50, p=0.0016),其直线回归方程:SIZE=18.44+1.14APOP.。③心肌细胞凋亡率与左室功能的相关性分析:⑴与左室收缩压呈负相关(n=50, r=-0.60, p=0.0001),其直线回归方程: LVSP=143.35-2.35 APOP.;⑵与左室舒张末压呈正相关(n=50,r=0.42,p=0.0024),其直线回归方程: LVEDP=-1.52+0.66APOP.;⑶与左室内压最大下降速率呈负相关(n=50, r=-0.68, p=0.0001),其直线回归方程:dp/dtmin =7095.75-211.37APOP.;⑷与等容相左室压力下降时间常数呈正相关(n=50,r=-0.34, p=0.0039),其直线回归方程:τ=14.58-0.27APOP.;④在左室收缩压与损伤面积、凋亡率多元回归模型中,回归方程为: LVSP=160.86-1.2SIZE-0.76APOP.(P=0.0001),41.91%左室收缩压下降是由于心肌损伤纤维化和心肌细胞凋亡率增加所致(P SIZE =0.0006, P APOP. =0.0313)。⑤在左室舒张末压与心率和凋亡率多元回归模型中,回归方程为: LVEDP=-13.51+0.03HR +0.6APOP.(P=0.0021),23.03%左室舒张末压增加是由于心肌细胞凋亡率增加所致(P HR =0.0757, P APOP. =0.0051)。⑥AMI和AMI+ capt. +carv.大鼠心肌细胞损伤坏死最严重-细胞器数量明显减少、线粒体部分或大部分嵴膜融合消失、部分肌节排列紊乱、核即将融解消失;联用螺内酯组的变化较轻,仅表现为线粒体部分嵴、膜融合消失和糖原数量减少,双层核膜融合,与醛固酮对心肌细胞的损伤和螺内酯对心肌细胞的保护作用一致。小结1.在左室晚期重塑过程中,损伤坏死边缘部位心肌细胞凋亡率和损伤坏死面积与心功能具有显著的相关性,并独立地影响心功能不全的进展。2.醛固酮受体拮抗剂-螺内酯可能通过减轻损伤边缘部位尚存心肌细胞凋亡和损伤坏死面积两条途径,并二者相互作用减缓左室心肌重构和心功能不全的进展。3.螺内酯可能通过线粒体信号通路,改善心肌细胞线粒体功能,从而阻断Caspase蛋白级联反应,抑制细胞凋亡。