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目的：制备以阿霉素（Doxorubicin，DOX）为母药的靶向肿瘤内高表达的内肽酶Legumain前药：N-苄氧基羰基-Ala-Ala-Asn-阿霉素（CBZ-AAN-DOX），并考察其抗肿瘤的靶向性及药效作用。
方法：采用计算机辅助药物设计的方法以DOX为母药化学合成CBZ-AAN-DOX，结合高通量液相色谱、红外光谱、紫外光谱及核磁共振等方法对其进行表征检测，并在体外进行特异性酶解实验。采用WesternBlot检测乏氧诱导下人宫颈癌CaSki细胞中Legumain的表达。MTT法考察CBZ-AAN-DOX对CaSki细胞增殖抑制的影响。考察CBZ-AAN-DOX对斑马鱼胚胎的毒性。CBZ-AAN-DOX以最大给药剂量25mg/kg给药考察其对小鼠生存期、体重、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏以及外周血白细胞的影响，考察其对小鼠的潜在毒性作用。采用BALB/C裸鼠荷瘤模型考察CBZ-AAN-DOX对肿瘤生长的影响。免疫组织化学检测Legumain在肿瘤以及正常组织中的表达情况，通过液相色谱法检测给药处理12h内CBZ-AAN-DOX在主要组织器官以及肿瘤中的分布情况。采用划痕实验和Transwell基质胶侵袭实验考察CBZ-AAN-DOX对CaSki细胞迁移和侵袭的影响。采用斑马鱼荷瘤模型考察CBZ-AAN-DOX对肿瘤细胞转移及斑马鱼肠下静脉生成的影响。
结果：红外光谱、紫外光谱结合核磁共振结构验证表明合成的前药与设计一致：目标前药的分子结构组成为C45H51N5O17，分子量为956，高通量液相色谱检测药物纯度为96%，体外CBZ-AAN-DOX被rhLegumain酶解的最大速度Vmax=2.58μM/(L?s),Km=61.4μM。缺氧培养条件下CaSki细胞中Legumain的表达比正常培养环境中的表达量显著提高，CBZ-AAN-DOX对CaSki细胞的IC50为28.62μM，比DOX降低3倍，与对斑马鱼胚胎的毒性作用相同，且未见对斑马鱼胚胎心脏发育产生影响。小鼠体内毒性试验发现，CBZ-AAN-DOX在25mg/kg给药处理下未见小鼠个体死亡，而DOX在等量给药处理小鼠在14天内全部死亡。病理切片检测结果表明CBZ-AAN-DOX对心脏、肝脏、肾脏、脾脏及肺脏无影响或影响较小，而DOX对小鼠心脏和肾脏损害严重，7天内CBZ-AAN-DOX对小鼠外周血白细胞基本无影响。CBZ-AAN-DOX在13.77μM/kg给药剂量下对小鼠移植瘤的体积抑制为54%，免疫组化结果表，Legumain在肿瘤中大量表达，而在内脏器官中低表达或不表达，前药能够在肿瘤组织内维持一定的药物浓度。41.8μM浓度的DOX或13.9μM浓度的CBZ-AAN-DOX都能抑制CaSki细胞的迁移能力，且CBZ-AAN-DOX（抑制率60%）对细胞的迁移抑制能力比DOX（抑制率48%）更为显著，CBZ-AAN-DOX在13.9μM浓度下对CaSki细胞的侵袭抑制率达到98%（DOX为51%），而且CBZ-AAN-DOX能够抑制斑马鱼胚胎肠下静脉的生长以及斑马鱼荷瘤模型体内肿瘤细胞的转移。
结论：本实验制备的小分子靶向前药CBZ-AAN-DOX在酸性条件下能被rhLegumain酶水解释放出母药DOX发挥其药效，其靶向抗肿瘤作用增强，毒副作用降低，可能成为一种高效、低毒和靶向抗宫颈癌的候选药物。
方法：采用计算机辅助药物设计的方法以DOX为母药化学合成CBZ-AAN-DOX，结合高通量液相色谱、红外光谱、紫外光谱及核磁共振等方法对其进行表征检测，并在体外进行特异性酶解实验。采用WesternBlot检测乏氧诱导下人宫颈癌CaSki细胞中Legumain的表达。MTT法考察CBZ-AAN-DOX对CaSki细胞增殖抑制的影响。考察CBZ-AAN-DOX对斑马鱼胚胎的毒性。CBZ-AAN-DOX以最大给药剂量25mg/kg给药考察其对小鼠生存期、体重、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏以及外周血白细胞的影响，考察其对小鼠的潜在毒性作用。采用BALB/C裸鼠荷瘤模型考察CBZ-AAN-DOX对肿瘤生长的影响。免疫组织化学检测Legumain在肿瘤以及正常组织中的表达情况，通过液相色谱法检测给药处理12h内CBZ-AAN-DOX在主要组织器官以及肿瘤中的分布情况。采用划痕实验和Transwell基质胶侵袭实验考察CBZ-AAN-DOX对CaSki细胞迁移和侵袭的影响。采用斑马鱼荷瘤模型考察CBZ-AAN-DOX对肿瘤细胞转移及斑马鱼肠下静脉生成的影响。
结果：红外光谱、紫外光谱结合核磁共振结构验证表明合成的前药与设计一致：目标前药的分子结构组成为C45H51N5O17，分子量为956，高通量液相色谱检测药物纯度为96%，体外CBZ-AAN-DOX被rhLegumain酶解的最大速度Vmax=2.58μM/(L?s),Km=61.4μM。缺氧培养条件下CaSki细胞中Legumain的表达比正常培养环境中的表达量显著提高，CBZ-AAN-DOX对CaSki细胞的IC50为28.62μM，比DOX降低3倍，与对斑马鱼胚胎的毒性作用相同，且未见对斑马鱼胚胎心脏发育产生影响。小鼠体内毒性试验发现，CBZ-AAN-DOX在25mg/kg给药处理下未见小鼠个体死亡，而DOX在等量给药处理小鼠在14天内全部死亡。病理切片检测结果表明CBZ-AAN-DOX对心脏、肝脏、肾脏、脾脏及肺脏无影响或影响较小，而DOX对小鼠心脏和肾脏损害严重，7天内CBZ-AAN-DOX对小鼠外周血白细胞基本无影响。CBZ-AAN-DOX在13.77μM/kg给药剂量下对小鼠移植瘤的体积抑制为54%，免疫组化结果表，Legumain在肿瘤中大量表达，而在内脏器官中低表达或不表达，前药能够在肿瘤组织内维持一定的药物浓度。41.8μM浓度的DOX或13.9μM浓度的CBZ-AAN-DOX都能抑制CaSki细胞的迁移能力，且CBZ-AAN-DOX（抑制率60%）对细胞的迁移抑制能力比DOX（抑制率48%）更为显著，CBZ-AAN-DOX在13.9μM浓度下对CaSki细胞的侵袭抑制率达到98%（DOX为51%），而且CBZ-AAN-DOX能够抑制斑马鱼胚胎肠下静脉的生长以及斑马鱼荷瘤模型体内肿瘤细胞的转移。
结论：本实验制备的小分子靶向前药CBZ-AAN-DOX在酸性条件下能被rhLegumain酶水解释放出母药DOX发挥其药效，其靶向抗肿瘤作用增强，毒副作用降低，可能成为一种高效、低毒和靶向抗宫颈癌的候选药物。