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目的:
流行性感冒病毒(influenza virus)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常常感染人并导致严重疾病，在人群中迅速传播，成为威胁人类健康的常见病原体之一。由于流感病毒是分节段的RNA病毒，容易发生错配的RNA依赖的RNA聚合酶和基因重组导致抗原漂移和抗原转换，尤其是表面糖蛋白抗原—血凝素(hemagglutinin, HA)最易发生变异，使流感在人群中不断形成流行。2009年A/H1N1型流感的爆发再次引起全球的关注。目前使用的抗流感疫苗只含几种常见流行株，主要是诱导机体产生HA特异性中和抗体，只对所含型别有效，对预防变异株感染无效。世界卫生组织根据每年流感流行情况，对疫苗组合进行调整，而疫苗的研制常常滞后于流感病毒抗原的变异。所以，研发可以抵御所有流感病毒感染，减轻感染的严重性并且在爆发时限制疾病的传播的“通用型”疫苗成为对科学界的挑战。
流感病毒感染诱导产生以系统和局部抗体反应为代表的特异性体液免疫以及以特异性T细胞反应为代表的细胞免疫，二者对宿主抗病毒感染都很重要。因为针对疫苗产生的特异性抗体，不能阻止已发生变异的流感病毒感染，研究人员开始考虑能否通过提高细胞免疫的方法，达到预防异型流感病毒感染的目的。哪种细胞免疫反应在抗异型流感病毒免疫中起主要作用？其机制是什么？目前无统一的结论。我们在前期研究中发现，异型流感病毒间存在部分交叉保护作用，而且IL-2可以提高异型流感病毒感染组的生存率。为探讨其机制，本研究重点研究异型流感病毒感染后T淋巴细胞增殖活性和IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞水平的变化。本实验分为两部分，一部分研究将同型和异型流感病毒感染小鼠进行比较研究;另一部分，将应用IL-2及未应用IL-2的异型流感病毒感染小鼠进行比较研究。希望能为制备“通用型”流感疫苗奠定基础。
方法:
一、病毒滴度测定
将A/FM/47(H1N1)流感病毒株的病毒储存液用PBS溶液进行10倍等比稀释(10-1-10-10)，把各稀释液分别接种于9日龄鸡胚尿囊腔中，33-35℃孵箱培养，根据Reed-Muench方法，计算鸡胚半数感染量。
二、动物分组
雌性，6-8周龄C57BL/6小鼠随机分成实验组和对照组
(1)异型流感病毒感染研究
实验1组（同型免疫组）:用A/H1N1型流感病毒免疫，A/H1N1型流感病毒感染;实验2组（异型免疫组）:用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，A/H1N1型流感病毒感染;对照1组（未免疫感染对照组）:用PBS代替疫苗，A/H1N1型流感病毒感染;对照2组（空白对照组）:正常饲养，不做任何处置。
(2)应用IL-2后异型流感病毒感染研究
实验1组（异型免疫组）:用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，A/H1N1型流感病毒感染;实验2组（异型免疫加强组）:用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，同时使用IL-2，最后进行A/H1N1型流感病毒感染;对照1组（单纯使用IL-2组）:只用IL-2后感染A/H1N1型流感病毒;对照2组（未免疫感染对照组）:用PBS代替疫苗，感染A/H1N1型流感病毒;对照3组（空白对照组）:正常饲养，不做任何处置。
三、免疫动物、
用A/H1N1流感病毒或A/H5N1型流感病毒疫苗按上述分组参照文献和说明书免疫动物。使用IL-2组，免疫的同时连续注射IL-2，0、1、2天。首次免疫三周后加强免疫一次，方法剂量同上。
四、感染动物
加强免疫两周后，按上述分组每只小鼠经鼻腔感染A/H1N1型流感病毒。正常饮食饮水饲养，感染病毒后每天准确称量小鼠体重，观察饮食饮水及精神状态。
五、MTT法测定T淋巴细胞增殖活性
分别在感染前、感染后5天、7天取小鼠脾细胞，接种于96孔板，每个样本做3个复孔，每板设置空白对照，湿润环境下，37℃，5％CO,孵育68小时后进行MTT实验，570nm读取A值。
六、IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞的测定
分别于感染前、感染后5天、7天、14天取小鼠脾细胞。用CD3e-PerCP、CD8a-PE进行表面染色，然后向细胞悬液中加入IFN-γ-FITC进行胞内染色，最后在流式细胞仪上读取数据。
七、统计学分析
用SPSS18.0进行统计分析，以P＜0.05为统计学差异显著。
结果:
一、感染病毒滴度测定根据Reed-Muench方法，计算EID50为104.8
二、异型流感病毒感染研究
①T淋巴细胞增殖活性
1、实验1组（同型免疫组）和实验2组（异型免疫组）T淋巴细胞增殖活性在感染后5天、7天都高于对照1组（未免疫感染对照组），差别显著(P＜0.05);但是实验1组（同型免疫组）与实验2组（异型免疫组）差别不显著。
2、实验1组（同型免疫组）感染后7天的T淋巴细胞增殖活性高于感染前，(P＜0.05)。实验2组（异型免疫组）感染后5天、7天的T淋巴细胞增殖活性均高于感染前，且差异显著(P＜0.05);同时，感染后7天的T淋巴细胞增殖活性高于感染后5天的，差异显著(P＜0.05)。
②IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞的测定
(1)实验2组（异型免疫组）IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞的水平在感染后7天高于实验1组（同型免疫组），差别显著(P＜0.05)。实验2组（异型免疫组）与对照1组（未免疫感染对照组）差别显著(P＜0.05)。
(2)实验2组（异型免疫组）IFN-γ阳性CD3℃D8+淋巴细胞的水平在感染后7天出现一个高峰值，与感染前和感染后5天、14天差别显著(P＜0.05)。
三、应用IL-2后异型流感病毒感染研究
①T淋巴细胞增殖活性
(1)实验1组（异型免疫组）和实验2组（异型免疫加强组）在感染后T淋巴细胞增殖活性增强;实验1组（异型免疫组）与对照1组（单纯IL-2免疫组）、对照2组（未免疫感染对照组）差别显著(P＜0.05)。实验2组（异型免疫加强组）与对照2组（未免疫感染对照组）差别显著(P＜0.05)。
(2)实验1组（异型免疫组）感染后5天T淋巴细胞增殖活性较比感染前高(P＜0.05)，感染后7天继续升高，与感染前和感染后5天均差别显著(P＜0.05)。实验2组（异型免疫加强组）趋势与实验1组相似。
②IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞的测定
(1)实验1组（异型免疫组）和实验2组（异型免疫加强组）在感染后7天IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞的水平均出现峰值。实验2组（异型免疫加强组）与实验1组差别显著(P＜0.05)，与对照1组（单纯IL-2免疫组）、对照2组（未免疫感染对照组）差别显著(P＜0.05)。
(2))实验1组（异型免疫组）和实验2组（异型免疫加强组）IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞的水平在感染后7天出现一个高峰值，与感染前和感染后5天、14天差别显著(P＜0.05)。
结论:
1、异型流感病毒感染后产生的交叉保护可能与T淋巴细胞增殖有关。
2、异型流感病毒感染免疫与IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞(CTL)的水平相关，并有时间限制性。
3、IL-2可以加强异型流感病毒感染后IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞(CTL)的水平，可能为加强抗异型流感的交叉保护作用的重要方式。