论文部分内容阅读
为了探讨GHR基因大片段缺失引起矮小型鸡肌内脂肪沉积增加的机制，本研究作了以下三项研究工作：(1)分别对7周龄矮小型鸡和正常型鸡作了遗传分析，体重、体尺测量，血浆中IGF-1、T3、T4激素水平测定，肌肉组织学特性分析以及肌内脂肪含量测定；(2)分别运用miRNA和mRNA微阵列技术分析骨骼肌中的miRNA和mRNA表达谱，并且联合分析差异表达miRNA的靶基因预测谱和mRNA差异表达谱，找到影响IMF的关键基因，并总结了miRNA通过这些关键基因及相关基因通路对IMF沉积产生影响的机制；(3)用实时荧光定量PCR法检测了几种胞外信号因子、脂肪细胞关键转录因子以及脂肪调控候选基因mRNA表达量的变化，并且对它们之间的相互影响进行了分析，总结了影响矮小型鸡IMF沉积的其他可能基因信号通路。结果如下： (1)矮小型鸡GHR基因外显子10和3’UTR区上有大片段碱基缺失突变且没有编码区的剪切位点突变，而正常型鸡GHR基因不存在突变；在各个生长阶段，矮小鸡的平均体重均小于正常型鸡，但是在4到7周龄时，它们的差异达到极显著水平(P<0.01)；与正常鸡相比，矮小型鸡的体斜长、龙骨长和胫长均极显著低(P<0.01)，且胫围显著低(P<0.05)；矮小型鸡血浆中的IGF-1含量极显著低(P<0.01)，且T3和T4的含量显著低(P<0.05)，但是T3/T4却极显著高(P<0.01)；矮小型鸡的肌原纤维直径、肌节长度、肌原纤维明带长度、肌大束间距与正常鸡相比差异不显著(P>0.05)，但是肌纤维间距显著低(P<0.05)，肌纤维密度显著高(P<0.05)，且肌纤维直径极显著低(P<0.01)；矮小型鸡肌内脂肪含量(IMF)极显著高(P<0.01)。 (2)miRNA差异表达谱显示，两种鸡骨骼肌中差异表达miRNA较少，只有let7b和miR128；mRNA差异表达谱显示，7周龄时正常型鸡对矮小型鸡骨骼肌中mRNA差异表达倍数在2倍以上的基因共有173个，其中表达上调的基因有108个，下调的基因有65个；靶基因预测结果显示，let-7b和miR128分别有保守靶基因268和401个，且mRNA差异表达谱中GHR是let-7b的靶基因，NRID2和RORa是miR128的靶基因。对GHR基因参与的Jak-STAT信号通路和mRNA差异表达谱进行联合分析发现了SOCS3基因。再对SOCS3基因进行信号通路分析，发现其参与脂肪细胞因子信号通路(Adipocytokine Signaling Pathway)，从脂肪细胞因子信号通路可以看到，SOCS3基因主要通过抑制LEPR基因，来间接增加PPARα的表达。然后我们又对PPARα进行通路分析，发现了其参与PPAR信号通路(PPAR Signaling Pathway)，并且PPARα促进LPL的表达。总之，let-7b先通过抑制其靶基因GHR，从而抑制SOCS3，然后间接促进LEPR，抑制PPARα，LPL，最后抑制脂肪沉积。但是矮小型鸡由于GHR基因大片段的碱基缺失，导致其丧失了let-7b的靶位点，减小了let-7b的作用，导致矮小型鸡IMF沉积增加。另外，在矮小型鸡上，miR-128的表达量下降，使其对NR1D2基因的沉默作用减弱，从而使NR1D2的表达大幅增加，从而间接促进矮小鸡IMF沉积。RORα在矮小型鸡上的表达是降低的，所以对IMF沉积抑制作用减弱；同时其对NR1D2抑制作用也减弱，同样可以相对促进NR1D2的表达。miR-128对RORα基因的沉默作用则不确定，因为它们在矮小型鸡上的表达量都是一致性降低的。 (3)与正常型鸡相比，矮小型鸡胞外信号因子Wnt10α、Cateninβ、TGFβ3的mRNA表达量均极显著下调(P<0.01)；脂肪细胞关键转录因子C/EBPβ的mRNA表达量极显著上调(P<0.01)，PPARα、C/EBPα的mRNA表达量显著上调(P<0.05)，PPARγ和C/EBPγ的mRNA表达量分别上调和下调，但是差异不显著(P>0.05)；脂肪调控候选基因THRSP的mRNA表达量极显著上调(P<0.01)，而且LPL的mRNA表达量显著上调(P<0.05)。总之，矮小型鸡GHR基因缺失突变导致Wnt10α、Cateninβ及TGFβ3的表达量极显著下调，使其对C/EBPα、PPARγ的抑制作用减弱，因而其表达量相对上调，并由此上调LPL、THRSP的表达量；C/EBPγ的表达量减少，使其对C/EBP-β表达的抑制作用减弱，从而间接增加了C/EBPβ对C/EBPα、PPARγ表达的促进作用；而PPARα的表达量上调，促进了LPL、THRSP的表达量上调。 由此我们推测，矮小型鸡肌内脂肪沉积增加是let7b、miR128等miRNA和很多基因信号通路协同调控的结果。