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犬腺病毒（Canine Adenovirus,CAV）属腺病毒科（Adenoviridae）哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）成员,是引起犬上呼吸道症状的主要传染性病原之一,该病原不仅对全球养殖犬造成极大危害,同时对野生动物例如狐狸、熊、狼等生物多样性造成极大威胁。CAV有分为两种血清型,犬腺病毒1型（Canine Adenovirus 1,CAV-1）主要引起犬急性败血性肝炎及熊和狐脑炎,致死率极高;犬腺病毒2型（Canine Adenovirus 2,CAV-2）主要引起犬科动物传染性喉气管炎等呼吸道症状。不同类型的CAV-2型毒株随着进化起引起的临床症状也不断变化,1962年Dithfield首次分离CAV-2毒株（Toronto A26/61株）仅引起呼吸道疾病[1],在1985年Hamelin和1988年Macartney等人发现CAV-2可以在犬的消化道中增殖引起犬腹泻[2,3]。近年来宠物经济崛起,我国城市宠物犬量达5222万只[4],也是全球狐狸、貉子等毛皮经济动物饲养大国,同时我国也是山狼、狐狸、貉、负鼠、熊等野生动物的主要栖息地。我国宠物犬用疫苗完全依赖进口,临床常见接种疫苗的宠物犬和狐狸感染CAV-2的报道[5]。2019年,我国某两个省份等地比格犬养殖场免疫接种犬暴发CAV-2疫情,部分犬因肺脏严重出血而死亡;为探究免疫犬仍发病的原因,本研究与国内爆发疫情比格犬养殖场和14座宠物医院进行合作,大范围的收集临床病料;分离出国内流行毒株3株,并进行系统鉴定,同过建立犬腺病毒2型人工感染模型,通过该模型评价国内外商品化犬四联活疫苗对国内犬群中流行毒株的免疫保护效果,对后期我国CAV-2用诊断试剂和疫苗的研究奠定坚实基础。I犬腺病毒2型的分离与鉴定将处理后的单纯CAV-2感染的犬病料接种于MDCK细胞,其中3份在显微镜观察下MDCK细胞出现体积变大、变圆、聚团、聚集成葡萄串状、通透性增强、严重时细胞脱落等典型的细胞病变。随后将细胞病毒混合培养物经PCR/RT-PCR、电镜观察、间接免疫荧光试验、E3、Fiber、Penton、E1b基因测序等分析方法对所分离的病毒进行系统性鉴定,结果显示3株毒株均为CAV-2型毒株。随后挑选一株进行生长动力学研究;然后从3株毒株中挑选1株生长状态良好、纯净性高、病毒滴度高的HB405株毒株进行回归犬致病性研究。结果显示犬腺病毒2型3株分离株之间的同源性在98.8%～100%;3株毒株与进口疫苗株和经典毒株Toronto毒株进化树分析位于同一分支,同源性分别为98.4%～99.9%、98.5%～100%,与疫苗株同源性极高,怀疑其为疫苗株,国内部分流行毒株与疫苗株不在同一分支,也是免疫失败的原因之一;回归本动物试验结果显示,感染犬出现体温升高超39.5℃以上、精神不振、食欲减退、眼鼻分泌物,且出现打喷嚏、咳嗽等典型的上呼吸道临床症状,感染后持续排毒7～9日不等。最终结果表明犬腺病毒2型HB405株是一株对犬有致病力的强毒株。结合进化树分析不排除进口疫苗中CAV-2毒株存在毒力返强的可能性。II犬腺病毒2型人工感染模型的建立将犬腺病毒2型HB405毒株稀释成103.0TCID50/ml、104.0TCID50/ml、105.0TCID50/ml不同剂量分别接于比格犬。结果显示,不同剂量感染犬均可使犬发病,发病率均为100%;105.0TCID50/ml组可导致犬发生眼鼻分泌物、精神不振、食欲减退、打喷嚏等症状,105.0TCID50/ml组解剖发现犬肺脏发生红色实变最为严重;HE染色和组化实验发现显示肺部大面积肺泡2型上皮细胞增生形成管腺样结构,细支气管腔及肺泡腔内大量脱落的细胞,局灶性出血;喉头有局灶性出血;而其他攻毒剂量犬肺脏解剖未观察到病变;105.0TCID50/ml组,CAV-2排毒检测排毒时间最长;症状较为明显,肺脏实变较为严重;结果表明犬腺病毒2型HB405株最适感染剂量是105.0TCID50/ml,本试验成功建立犬腺病毒2型人工感染犬模型。III犬腺病毒2型人工感染模型的应用本研究采购商品化犬四联活疫苗包括进口A、进口B和国产C,3种品牌分别接种5只犬,另一组5只犬作为对照组不进行免疫,免疫组二次免疫后21日,所有犬接种犬腺病毒2型HB405毒株,对国内外犬腺病毒疫苗进行效力评价,结果显示攻毒对照组犬5/5发病,均出现食欲不振、精神减退、打喷嚏、干呕、体温升高、眼鼻分泌物典型症状的情况下,进口A免疫组犬症状较轻,1/5出现眼鼻分泌物,持续1-2天恢复;进口B免疫组5/5发病,有食欲减退、眼分泌物和打喷嚏临床症状;国产C免疫组5/5发病;有精神不振、食欲减退、打喷嚏等临床症状;CAV-2排毒检测显示免疫组和对照组均有排毒现象,结果表明进口或国产CAV-2疫苗免疫后,仅能起到有效减轻发病临床症状、缩短发病时间的作用;不能对国内犬腺病毒2型流行毒株起到100%的保护。