【摘 要】
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目的:研究中性粒细胞在卡介苗（BCG）刺激下中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）能否形成及NETs对BCG的捕获和杀菌效率的影响,初步探讨NETs形成的分子机制。利用基因芯片技术筛选出中性粒细胞在BCG刺激下差异基因的表达,从而探索中性粒细胞在BCG介导的细胞免疫反应中所发挥的作用。方法:从健康青年志愿者的外周血中分离出中性粒细胞,进行（1）利用细胞荧光染色法对BCG刺激后的中性粒细胞进行荧光染色,共
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目的:研究中性粒细胞在卡介苗（BCG）刺激下中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）能否形成及NETs对BCG的捕获和杀菌效率的影响,初步探讨NETs形成的分子机制。利用基因芯片技术筛选出中性粒细胞在BCG刺激下差异基因的表达,从而探索中性粒细胞在BCG介导的细胞免疫反应中所发挥的作用。方法:从健康青年志愿者的外周血中分离出中性粒细胞,进行（1）利用细胞荧光染色法对BCG刺激后的中性粒细胞进行荧光染色,共聚焦显微镜下观察NETs的形成;利用扫描电子显微镜观察BCG刺激中性粒细胞NETs的形成及其捕获BCG的情况;利用细胞松弛素D抑制中性粒细胞的吞噬和脱颗粒作用,从而检测形成NETs对BCG的杀菌效率;用DNase预处理的中性粒细胞在BCG刺激下观察NETs的形成;（2）ROS检测试剂盒检测中性粒细胞在不同组中释放ROS的情况;中性粒细胞在NADPH蛋白酶抑制剂和信号通路抑制剂预处理后,用荧光染色的方法观察BCG刺激下NETs的形成,并用IPP软件计数NETs形成的百分比;（3）利用基因芯片表达谱筛选中性粒细胞在BCG刺激下差异基因的表达,并对差异基因进行初步功能分析。结果:（1）BCG感染中性粒细胞能形成NETs,NETs中主要成分是DNA、组蛋白、弹力蛋白酶等;DNase对NETs的形成有抑制作用,降解NETs的形成;中性粒细胞形成NETs对BCG有捕获并杀灭的作用。（2）NADPH氧化酶抑制剂DPI和ROS清除剂Acetylcysteine预处理的中性粒细胞在BCG刺激下未能观察到NETs的形成,也没有产生ROS;同样用PI3K抑制剂、PKC抑制剂、MEK抑制剂预处理的中性粒细胞在BCG刺激下都没有观察到NETs的形成以及ROS的产生,相反,用p38MAPK抑制剂和JNK抑制剂预处理的中性粒细胞在BCG刺激下仍然能观察到NETs的形成及ROS的产生。（3）BCG刺激下的中性粒细胞与未受BCG刺激的中性粒细胞相比表现出明显的差异基因的改变,说明BCG对中性粒细胞功能的改变起到重大的影响;在BCG介导的细胞免疫反应中,中性粒细胞在Cytokine-cytokine receptor interaction信号通路、Chemokine signaling pathway信号通路和Focal adhesion信号通路中起到重要作用。结论:BCG能诱导中性粒细胞形成NETs,NETs的形成对BCG也有捕获和杀菌作用;ROS是BCG诱导中性粒细胞NETs形成所必需的;PI3K信号通路调节细胞的自噬作用在BCG诱导的中性粒细胞NETs的形成中起到重要作用;在BCG诱导的中性粒细胞NETs形成的过程中PKC、MEK可能处于ROS产生的上游信号通路,而p38MAPK、JNK可能处于ROS产生的下游信号通路。中性粒细胞在BCG刺激下能表达明显的差异基因。
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