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近年来,随着干细胞研究的深入,成体干细胞逐渐显示出越来越多的优势,它具有来源丰富,可塑性强,离成熟细胞较近,具有多向分化潜能等特点。最大特色是可以实现个体化治疗,无免疫排斥问题,因而将优先进入临床使用。它可以从接受治疗者体内直接分离,进行体外大量增殖,并诱导分化为所需要的细胞种类,然后再将它们移植回接受治疗者体内,这样就不会因发生免疫排斥反应而失败,同时还可以避免因使用胚胎干细胞所带来的伦理上的争端和成瘤性的危险。
脂肪源性干细胞是一种成体干细胞。经研究证实它具有易于分离,易于培养,传代多次而没有明显衰减的生物学特性,并有多向分化潜能,能在体外培养情况下,经添加特异性诱导培养基定向分化培养成为成骨细胞,软骨细胞,心肌细胞,平滑肌细胞和脂肪细胞,并能跨胚层分化为上皮细胞,肝样细胞和神经元样细胞,从而显示了它作为一种细胞治疗的良好载体和组织工程中种子细胞的广阔的临床应用价值。
目前所进行的有关脂肪源性干细胞的研究主要集中在它具有的一些生物学特性上,主要是一些细胞的体外实验,没有细胞在活体动物体内的实验观察。本研究为了能进一步开发它在组织工程中的应用价值,特别是乳腺整形中的作用,希望它作为脂肪组织工程的种子细胞能尽早进入临床应用,做了脂肪源性干细胞的脂肪定向诱导分化及动物体外体内实验,因为临床脂肪颗粒注射治疗存在高吸收率问题,而且一次获得的细胞数量有限,需要多次注射,故本研究也模拟临床情况进行细胞多次注入。
研究目的:
从脂肪组织中分离,培养,鉴定脂肪源性干细胞并诱导成为为脂肪细胞,将经过BrdU标记并诱导后的细胞多次注入NOD-SCID小鼠体内,观察细胞在活体动物体内的生长情况和对动物的影响。
研究方法:
1.无菌技术取SD大鼠双侧腹股沟脂肪垫,用I型胶原酶消化,获取脂肪源性干细胞,接种于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中,观测其生长情况,绘制生长曲线,鉴定其表面分子标志CD29,CD44,CD45。
2.添加脂肪定向诱导剂,将脂肪源性干细胞诱导成为脂肪细胞,并用油红O染色鉴定。
3.将经过BrdU标记并诱导后的脂肪细胞连续三次,每次间隔十天,接种于NOD-SCID小鼠一侧皮下,对侧空白对照,观察小鼠生长情况并在注射细胞结束后一个月和两个月取材,观察组织细胞形态学变化并用油红O染色鉴定,BrdU免疫组化鉴定。
研究结果:
1.脂肪源性干细胞易于分离,培养,具有稳定的扩增能力,可传代十次,不易衰减。细胞表面分子标志鉴定结果:CD29,CD44分别为95%,98%,CD45为6%。
2.通过添加脂肪定向分化诱导剂,于培养第四天前后细胞出现脂滴,十天后脂肪细胞生成率60%以上,细胞形态学和油红O染色证实为脂肪细胞定向分化。继续培养可见细胞变圆从培养瓶底壁游离。
3.将BrdU标记过并诱导而生成的成熟脂肪细胞接种入NOD-SCID小鼠一侧背部皮下,对侧空白对照。观察到小鼠生长良好,注射细胞侧可见局部隆起,隆起直径约1cm,厚约2mm。对侧阴性。经组织切片发现存活于小鼠体内的细胞形态正常,没有异型性,经油红O染色证实为成熟脂肪组织。本实验分别观察了细胞注入NOD-SCID小鼠皮下一个月和两个月后的情况,发现两个月小鼠的移植脂肪细胞较一个月小鼠的移植脂肪细胞直径增大,表明经诱导后的细胞具有良好的生长能力,能适应从体外到体内的生存环境,并随着环境的变化而变化,这一点体现在它能随着小鼠的生长发育而积聚脂肪,成为成熟脂肪组织。而且因为本实验中细胞为多次注入,也为临床中分离培养细胞后多次治疗提供了一定的参考价值,同时也发现成活的脂肪组织中并没有明显的血管的生成,这说明成活的细胞可能主要是靠局部渗出的组织间液存活,同时因为局部脂肪的厚度仅为2mm左右,这也间接说明血管化的障碍可能也是影响细胞生长的重要因素。
结论:
1.脂肪源性干细胞易于提取,易于培养,不需额外添加很多营养物质就可生长良好。
2.脂肪源性干细胞体外培养增殖旺盛,经十次传代无明显衰减。
3.脂肪源性干细胞经CD29,CD44单克隆抗体表面标记阳性率高。CD45单克隆抗体表面标记阴性。
4.脂肪源性干细胞添加脂肪诱导培养基后,诱导为成熟脂肪细胞比率高。
5.脂肪源性干细胞诱导为成熟脂肪细胞后接种于NOD-SCID小鼠皮下,细胞可以成活,并随着小鼠的生长而积聚脂肪,脂肪细胞逐渐增大。
6.脂肪源性干细胞诱导为成熟脂肪细胞后可多次注入小鼠皮下而成活,提示临床多次治疗的可能。