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研究背景：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是一种常见的头颈部恶性肿瘤,其中舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)发病率最高(约占OSCC的25%-40%),具有高侵袭性的生长方式和淋巴结转移的特征。尽管癌症的治疗已经取得了重大进展,但从20世纪60年代至今,OSCC的死亡率基本保持不变,5年生存率徘徊在50%左右,复发和转移仍是影响预后的重要因素。然而肿瘤的复发和转移是个复杂的过程,这不仅依赖于肿瘤细胞内在的特征,还依赖于肿瘤所处微环境的一些因素。早在1979年,Lord就提出了肿瘤微环境的概念,即指肿瘤在其发生过程中的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞共同组成的一个复杂的集合系统。间质细胞和癌细胞之间可以相互诱导、相互作用,以利于肿瘤的增殖和侵袭。然而,在肿瘤微环境中常常存在着慢性炎症,这种炎症多数是由感染、低氧、低PH、高压等特性引起。存在大量的生长因子、细胞趋化因子和多种蛋白水解酶,所产生的免疫炎性反应有利于肿瘤的增殖、侵袭、粘附、血管生成以及对放、化疗的抵抗,促使恶性肿瘤产生和发展。不难发现,在对肿瘤微环境研究的很多方面都渗透着肿瘤与炎症的联系,肿瘤与炎症的关系已经成为肿瘤研究的新方向,肿瘤炎症微环境的研究已经成为当今肿瘤研究的热点。我们在前期实验中利用高通量、精确的蛋白质芯片技术(抗炎症因子芯片)对3种不同侵袭能力的人舌鳞癌细胞(UM-1、CAL-27、 Tca-8113)和人正常口腔黏膜上皮细胞培养上清中的炎症因子进行了初步筛选后发现,与侵袭性相对较低肿瘤细胞(Tca-8113)和正常口腔黏膜细胞相比,巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)、巨噬细胞炎症蛋白-3α (MIP-3α)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)在侵袭性相对较高的肿瘤细胞株(UM-1、CAL-27)中高表达。然而,在人舌鳞癌肿瘤细胞中MIP-1β、MIP-3α、IP-10相关受体CCR5、 CCR6、CXCR3的表达国内外尚未见文献报道,MIP-1β/CCR5、MIP-3α/CCR6、 IP-10/CXCR3轴在肿瘤的发生、发展过程中的具体机制还不清楚。MIP-1β、MIP-3α、IP-10都是趋化因子超家族成员,能够趋化细胞的定向运动。现在越来越多的研究发现,肿瘤细胞可以自分泌某些趋化因子,通过促进肿瘤细胞增殖,瘤内新生血管的生成,细胞外基质蛋白酶的分泌,或者抑制机体的抗肿瘤免疫,促进肿瘤生长、侵袭和转移。趋化因子和其相应的受体相互作用,在抗肿瘤的免疫、肿瘤的形成和转移等方面发挥着广泛的生理和病理作用。而在舌鳞癌中关于MIP-1β/CCR5、MIP-3α/CCR6、IP-10/CXCR3的相关研究较少,其各自在肿瘤的发生、发展过程中的具体机制还不清楚。本实验通过Western Blot和免疫荧光染色技术检测CCR5、CCR6、CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的表达情况；通过CCK-8法分别检测MIP-1β、MIP-3α、IP-10对人舌鳞癌细胞CAL-27增殖的影响；通过Annexin V/PI双染流式细胞仪分别检测其对CAL-27细胞凋亡的影响；通过Transwell侵袭实验及明胶酶谱实验检测其对CAL-27细胞侵袭性的影响,初步探讨MIP-1β、MIP-3α、IP-10在舌鳞癌发生发展过程中的作用。研究内容共分三章：第一章CCR5、CCR6、CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的表达；第二章MIP-1β、MIP-3α、IP-10对人舌鳞癌细胞CAL-27增殖、凋亡影响的研究；第三章MIP-1β、MIP-3α、IP-10对人舌鳞癌细胞CAL-27侵袭性影响的研究。第一章CCR5、CCR6、CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的表达1.目的：检测在3种人舌鳞癌细胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113中CCR5、CCR6、 CXCR3蛋白的表达及定位。为体外探讨MIP-1β、MIP-3α、IP-10对肿瘤细胞生物学行为的研究奠定基础。2.方法：取对数期生长良好的细胞用于实验,分别采用Western blot和免疫荧光染色对3种人舌鳞癌细胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113中CCR5、CCR6、CXCR3的表达进行检测。3.结果：Western blot结果显示CCR5、CCR6、CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株均有表达,分别在40.524k D、42.494k D、40.660k D处均可见蛋白表达条带。免疫荧光染色结果显示CCR5、CCR6、CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的细胞膜及胞质内均有表达。第二章：MIP-1β、MIP-3α、IP-10对人舌鳞癌细胞CAL-27增殖、凋亡影响的研究1.目的：观察MIP-1β、MIP-3α、IP-10对人舌鳞癌细胞CAL-27增殖、凋亡的影响。2.方法：1.取对数期生长良好的细胞,经无血清培养同步化处理24h后用于实验。根据MIP-1β(MIP-3α、IP-10)刺激浓度的不同,实验分别分为四组：对照组(0ng/mL组)、10ng/mL组、20ng/mL组、40ng/mL组。用CCK-8法分别检测各实验组和对照组在12h、24h、48h时,对CAL-27细胞增殖的影响。2.实验分组同前,根据实验分组分别加入0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mLMIP-1β(MIP-3α、IP-10)处理24h, Annexin V/PI双染流式细胞仪检测CAL-27细胞的凋亡情况。3.结果：(1)和对照组相比,12h、24h时,10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的MIP-1β对CAL-27细胞均有促进增殖的作用(P值均小于0.05)；48h时,10ng/mL、20ng/mL的MIP-1β对CAL-27细胞有促进增殖的作用(P值均小于0.05),但40ng/mLMIP-1β对CAL-27细胞的增殖无影响(P>0.05)；24h时,40ng/mL MIP-1β组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)；而10ng/mL、20ng/mL MIP-1β组细胞凋亡率和对照组之间无显著性差异(P值均大于0.05)。(2)和对照组相比,12h、24h、48h时,10ng/mL、20ng/ML、40ng/mL的MIP-3α对CAL-27细胞均有促进增殖的作用(P值均小于0.05),但各浓度之间没有显著性差异(P值均大于0.05)；24h时,各实验组CAL-27细胞凋亡率和对照组之间均无显著性差异(P值均大于0.05)。(3)和对照组相比,12h时,10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的IP-10均能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05),并且存在浓度依赖性；24h时,不同浓度的IP-10亦能够促进CAL-27增殖(P<0.05),但浓度依赖性消失；在48h时,只有40ng/mL的IP-10能够促进CAL-27增殖(P<0.05),10ng/mL、20ng/mL的IP-10对CAL-27细胞的增殖无促进作用(P>0.05)；当IP-10的刺激浓度为10ng/mL和20ng/mL时,随着作用时间的延长,其增殖率下降,在48h时对细胞增殖已无促进作用。24h时,各实验组CAL-27细胞的凋亡率均明显高于对照组(P值均小于0.05),但各浓度之间未见显著差异(P值均大于0.05)。第三章：MIP-1β、MIP-3α、IP-10对人舌鳞癌细胞CAL-27侵袭性影响的研究1.目的：观察MIP-1β、MIP-3α、IP-10对人舌鳞癌细胞CAL-27侵袭性的影响。2.方法：1.本实验采用Transwell侵袭实验分别观察对照组Ong/mL PBS和实验组80ng/mLMIP-1β (MIP-3α、IP-10)对人舌鳞癌细胞CAL-27侵袭性的影响；2.采用明胶酶谱实验分别验证实验组80ng/mL MIP-3α、IP-10对CAL-27细胞的促侵袭效应,并检测处理24h后各组细胞培养上清中MMP-2、MMP-9的酶活性情况。以相同体积的PBS溶液设为阴性对照。3.结果：Transwell侵袭实验结果显示：80ng/mL MIP-3a、IP-10组CAL-27细胞的侵袭率显著高于对照组(P均小于0.05),而80ng/mL MIP-1β组CAL-27细胞的侵袭率和对照组无显著性差异(P>0.05)；明胶酶谱实验结果显示：80ng/mL MIP-3α、IP-10组细胞培养上清中MMP-2、MMP-9的活性均显著高于对照组(P均小于0.05)。全文结论：1. CCR5、CCR6、CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的细胞膜及胞质中均有表达；2. MIP-1β对人舌鳞癌细胞CAL-27有促进增殖的作用,但相对较高浓度的MIP-1β对CAL-27的凋亡也有促进作用。随着较高浓度MIP-1β作用时间的延长,促增殖作用在减弱,而这种减弱可能是由较高浓度MIP-1β促凋亡作用的逐步发挥所引起的；3. MIP-3α对人舌鳞癌细胞CAL-27有促进增殖的作用,而对其凋亡无显著影响；4.IP-10既能促进CAL-27细胞的增殖又能促进其凋亡。随着作用时间的延长,[P-10的促增殖作用在减弱,而这种作用的减弱可能是由IP-10促凋亡作用的逐步发挥所引起的；5. MIP-3α、IP-10能够显著提高人舌鳞癌细胞CAL-27的侵袭性。