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一、研究目的鼻咽癌是我国两广地区最常见的头颈部恶性肿瘤,其发病可能与遗传易感性、EBV感染、环境与饮食习惯以及免疫功能缺陷相关。该病严重影响着我国人民的健康。如何改进鼻咽癌的治疗技术以及方法,提高疾病治愈率以及局部控制率,对提升人民的健康水平有着其实际的意义。鼻咽癌的治疗目前公认为是以放射治疗或者以放射治疗为主的综合治疗。早期鼻咽癌患者单纯放疗即能达到临床治愈,晚期患者需要选择以放射治疗为主的综合治疗。在放射治疗方面,鼻咽癌的放疗剂量已经基本恒定在70Gy左右。如何在保证病灶区域剂量的同时,减少周边正常组织的受量,是目前放射治疗在技术层面改进的方向。目的是在保证局部控制率不降低的情况下,减少口干以及张口困难等并发症的发生,提高患者的远期生活质量。现阶段已经出现IMRT, IGRT等新治疗技术,精确放射治疗的目标正在逐渐被推广。由于大部分鼻咽癌患者在发现时已经是局部晚期或者晚期,需要接受以放疗为主的综合治疗。并且恶性肿瘤本身是涉及全身性的疾病,配合放疗的全身治疗,如化疗、靶向治疗以及生物治疗,在鼻咽癌的综合治疗方面一样占据着重要地位。目前以细胞毒药物为主的化疗仍旧在晚期鼻咽癌的综合治疗中占据重要地位。但细胞毒药物具有副反应较重,患者耐受能力有限的缺陷,所以现阶段有人把研究热点逐渐转向靶向治疗以及生物治疗。由于鼻咽癌细胞表面EGFR高表达,所以针对阻断EGFR通路的靶向药物的研究为鼻咽癌药物治疗的研究热点,目前已经上市并投入使用的西妥昔单抗正是以EGFR通路的阻断为作用机制,并推广应用于临床中晚期患者的成熟药物。铜绿假单胞菌毛制剂(PA-MSHA)是铜绿假单胞菌的减毒制剂。它是自然界的铜绿假单胞菌(PA)在经过基因工程重组处理后,保留了高度的甘露糖亲和力以及免疫源性,而毒性明显下降的生物制剂。在国内临床应用已经比较广泛,并且也观察到明显的抗肿瘤疗效；基础研究方面认为其能够与EGFR表面的甘露糖结合而阻滞EGFR通路,同时激活免疫系统,兼有免疫调节功能,最终抑制靶细胞生长。所以该药物同时具有抑制EGFR通路以及免疫调节增强的功能。由于其价格较低,性价比较高,预计在临床应用方面前景比较广阔。本实验用体外实验的方法,研究铜绿假单胞菌毛制剂(PA-MSHA)对鼻咽癌细胞株5-8F以及6-10B的生长抑制作用,并且初步探讨其作用机制,为鼻咽癌的综合治疗新药选择提供依据。二、实验方法1.体外培养人鼻咽癌细胞株5-8F及6-10B,分为空白对照组及不同药物浓度处理组。不同浓度药物处理组的PA-MSHA浓度分别选择为：0.02×108/mh0.05×108/ml、0.1×108/ml、0.2×108/ml、0.5×108/ml、1×108/ml、2×108/ml、5×108/ml。处理时间1-7d。2.采用MTT法测定PA-MSHA对鼻咽癌5-8F以及6-10B的生长抑制作用。上述不同浓度的梯度的PA-MSHA分别与两组细胞株作用48h后,测定其吸光值,计算抑制率(IR),并绘制浓度-抑制率相关曲线。根据曲线分别计算半数抑制浓度(48hIC50)。分别根据两组细胞的IC50选择适宜的药物浓度(1×108/ml和2×108/ml)再次与两组细胞株相互作用1-7d,每天测定相应时间点的吸光值,绘制生长曲线,分析细胞增殖抑制情况与药物浓度及作用时间的关系。3.采用流式细胞技术分析经过PA-MSHA处理后的鼻咽癌5-8F的细胞周期分布情况。以1×108/ml浓度的PA-MSHA作用鼻咽癌5-8F细胞株24h,PI染色,上流式细胞仪检测细胞周期分布情况,分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率与空白对照组的区别。4. Westerm blot法检测经过不同浓度药物处理24h以及48h后的鼻咽癌5-8F以及6-10B的周期、凋亡相关蛋白级联水平变化。5. SPSS16.0统计软件,比较不同处理组细胞生长曲线采用析因分析的方法,不同处理组的细胞周期Go/G1比率用两独立样本t检验方法,P<0.05有统计学意义。三、实验结果1.细胞培养可见空白对照组鼻咽癌细胞呈短梭形,部分为类圆形,轮廓清晰,核仁明显,胞浆少。细胞网格状排列均匀,无胞突,饱满明亮,生长旺盛,一般在接种12小时后,能够适应新的生存环境,生长逐渐旺盛,并贴壁良好。两组细胞48小时IC50分别为(1.62+0.31)×108/ml和(1.95+0.35)×108/ml。在细胞培养的7天时间里,每天对两组细胞株的生长情况进行比较分析,可以发现PA-MSHA对鼻咽癌5-8F以及6-10B细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性。相同药物浓度组比较亦可发现发现PA-MSHA对鼻咽癌5-8F以及6-10B细胞的生长抑制作用呈时间依赖性。综合分析发现：铜绿假单胞菌毛制剂(PA-MSHA)明显抑制鼻咽癌细胞株5-8F的增殖,其增殖能力随时间的增加出现显著下降(F=665.403,P<0.001),并且该细胞株的增殖能力随PA-MSHA浓度梯度的增加而显著下降(F=151.607,P<0.001)。同样,PA-MSHA能够明显抑制鼻咽癌6-10B细胞株的增殖能力,其增殖能力随时间的增加出现显著下降(F=597.422,P<0.001)；并且该细胞株的增殖能力随PA-MSHA浓度梯度的增加而显著下降(F=74.481,P<0.001)。2.经过PA-MSHA处理后的鼻咽癌细胞株5-8F的细胞周期发生再分布。与对照组比较,药物处理后的细胞株细胞Go/G1期比例增高,差异具有统计学意义(t=5.150,P=0.007),而其S期比例显著降低(t=-6.820,P=0.002)。3. PA-MSHA处理后的两组细胞的周期相关蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6表达下调,凋亡促进相关蛋白Bax表达上调,凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达下调。并且在部分蛋白表达上体现出剂量-时间依赖的特点。结论1. PA-MSHA对鼻咽癌细胞生长有显著的抑制作用,并且其抑制的效应呈时间-浓度依赖性。2. PA-MSHA抑制鼻咽癌细胞增殖可能是通过抑制肿瘤细胞G1向S期转化以及诱导凋亡的发生而实现的。3. PA-MSHA可以考虑作为鼻咽癌综合治疗的辅助用药,具有一定的临床应用价值。