论文部分内容阅读
本文通过阐述冬虫夏草的分类地位、形态特征、生活史、寄主蝙蝠蛾幼虫等几个方面的研究概况,针对冬虫夏草菌存在多种学说以及到目前为止还未实现科赫法则的情况,提出研究冬虫夏草相关菌株这一问题的必要性;此外,文章中还详细阐述了冬虫夏草无性型、冬虫夏草相关菌株和微生物相互作用的研究情况。在此基础上,明确本研究的目的和意义,即通过普通生物学研究,了解相关菌株的生理特性并发现相关菌株对冬虫夏草菌的影响,为相关菌株的开发利用和侵染蝙蝠蛾幼虫提供一定的理论基础。利用实验室已有的冬虫夏草菌、蝙蝠蛾幼虫等资源以及中国被毛孢实验室培养技术。以甘肃省甘南榨油沟产冬虫夏草虫体为实验材料,分离得到13株相关菌株,用平板划线和显微镜挑取单个菌丝的方法对13株菌分别进行纯化,通过平板对峙试验的方法筛选出对冬虫夏草菌产生明显抑制作用的7株真菌,提取总DNA后以此为模板进行ITS序列扩增,测序并建立系统发育树。同时,对筛选的供试菌株进行最适温度、pH、最优碳源和氮源的生物学特性研究。另外,采用平板对峙的研究方法,分别和不同接菌时间的中国被毛孢进行3次对峙培养研究,观察共同生长时对中国被毛孢产生的影响,用供试相关菌株侵染蝙蝠蛾幼虫,观察记录相关菌株对蝙蝠蛾幼虫侵染力以及侵染后蝙蝠蛾幼虫的形态特征。最后,以上述结果为基础,分析相关菌株的生物学特性、对中国被毛孢的影响以及对蝙蝠蛾幼虫的侵染力。通过相关菌实验筛选实验得到了7株相关菌株,本研究对相关菌株定义为分离自冬虫夏草,对中国被毛孢的生长产生一定影响并对寄主幼虫有侵染力的菌株。形态学和分子生物学鉴定结果显示:3-2-1、3-4-2和3-5-2分别是曲霉属的杂色曲霉、肉色曲霉和田纳西曲霉,2F-2是棒束孢属的玫烟色棒束孢,JC-1是拟青霉属的蝙蝠蛾拟青霉,1-1是白僵菌属的白僵菌,其相似性均为99%以上。生物学特性研究表明:3-2-1、3-4-2和3-5-2的最适生长温度为23℃,最适pH为6.5,3-2-1的最优碳源为麦芽糖,3-4-2和3-5-2的最优碳源为蔗糖,这三株菌的最适氮源均为麸皮;2G-3-2的最适生长温度为23℃,最适pH为6.5,最优碳源为麦芽糖,最优氮源为牛奶;2F-2的最适生长温度为20-23℃,最适pH为7.5,最优碳源为可溶性淀粉,最优氮源为黄豆粉;JC-1的最适生长温度为20-23℃,最适pH为7.5,最优碳源为麦芽糖,最优氮源为牛奶和黄豆粉;1-1的最适生长温度为20-23℃,最适pH为7.5,最优碳源为蔗糖,最优氮源为麸皮。平板对峙实验结果显示:同时接菌时,相关菌株对中国被毛孢均产生了抑制作用,当中国被毛孢提前接菌30天时,相关菌株对中国被毛孢的抑制作用发生变化。三次试验中,3-2-1和3-4-2对中国被毛孢的抑制作用随着中国被毛孢生长稳定而减弱,甚至会转化成促进作用;而3-5-2对中国被毛孢的抑制作用同样随着中国被毛孢生长的稳定而减弱,但总体来说,3-5-2对中国被毛孢产生了抑制作用。2G-3-2和2F-2对中国被毛孢有强烈的抑制作用,但产生抑制的机制各不相同:2G-3-2对中国被毛孢的抑制作用是由于产生了抑制性代谢产物引起的,2F-2对中国被毛孢的抑制作用是营养竞争或重寄生作用引起的,这种抑制作用会随着中国被毛孢生长的稳定而减弱,但不会转变成促进作用。JC-1和1-1对中国被毛孢的抑制作用较强,这种抑制作用是因为相关菌株对中国被毛孢产生了营养竞争的作用或重寄生作用引起的,该抑制作用会因为中国被毛孢菌落直径的增大而减弱,但总体来说,相关菌株对中国被毛孢均有抑制作用。本研究证明供试相关菌株可侵染蝙蝠蛾幼虫,和中国被毛孢均是寄主蝙蝠蛾幼虫的致病菌;供试菌株与中国被毛孢在蝙蝠蛾幼虫体内至少存在营养竞争的关系;侵染力各不相同,由高到低依次为:JC-1、1-1>2F-2>3-4-2>3-5-2>3-2-1,说明各供试菌与中国被毛孢之间还存在其他关系,需要进一步研究证实。