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近年来分子生物学发展迅速,基因转染已经广泛用于多种实验方法和治疗方法中。为了让小鼠白血病细胞表达特定抗原分子作为肿瘤特异性抗原(TSA),我们选用逆转录病毒载体将目的基因转入靶细胞。本项实验工作,共分为两部分。实验一表达人CD4基因的逆转录病毒载体的构建目的构建高效稳定表达人CD4(hCD4)基因的逆转录病毒载体,使hCD4分子能稳定持久表达于靶细胞。方法利用PCR技术大量扩增hCD4 cDNA的目的基因,并引入酶切位点中,用连接酶将目的基因与载体pLXIN相连接,随后转入感受态大肠杆菌进行扩增,PCR鉴定出正确转染的阳性菌落,经酶切及测序证实hCD4目的基因已经成功转入载体(称为pLXIN-hCD4质粒)后,再用脂质体法将质粒pLXIN-hCD4转染到PT67包装细胞,经药物筛选出抗性克隆并扩增建系,收集含病毒颗粒的上清液以感染靶细胞。结果PCR菌落鉴定及酶切鉴定显示hCD4基因成功地插入pLXIN载体中,经测序与genebank中的序列完全一致。质粒pLXIN- hCD4转染成功的PT67细胞可以抵抗G418生长,将抗性细胞克隆挑出培养,得到稳定产生病毒颗粒的PT67细胞(为hCD4-PT67细胞)。结论本实验成功构建了能表达hCD4基因的重组质粒pLXIN-hCD4。实验二表达人CD4分子的L615细胞的获得及其细胞周期研究目的研究hCD4-PT67细胞产生的病毒颗粒感染小鼠T淋巴细胞白血病细胞系L615后(感染后称为L615-hCD4细胞),L615-hCD4细胞表达hCD4分子的情况,以及该细胞的细胞周期。方法收集hCD4-PT67细胞含病毒颗粒的上清液感染L615细胞,用G418筛选出感染成功的细胞,扩增后利用流式细胞仪检测L615-hCD4细胞表达hCD4分子的情况。并用PI-FCM法检测L615细胞和L615-hCD4细胞的细胞周期。结果感染所获得的L615-hCD4细胞高度表达hCD4分子,反复传代后hCD4分子仍稳定表达于L615-hCD4细胞膜表面。PI-FCM法检测细胞周期, L615-hCD4细胞与L615细胞相比,两者的细胞周期无特异性差异。结论本实验获得了稳定表达TSA(hCD4)的白血病细胞,其细胞周期与亲代细胞无差异。