论文部分内容阅读
牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周病、尤其是慢性牙周炎病损区域或炎症进展部位最主要的优势致病菌，它的存在与牙周病炎症进展或复发有关，是目前公认的慢性牙周炎的主要致病菌。P.gingivalis具有多种毒力因子，其中荚膜作为细菌表面结构，常与磷脂或脂质A共价结合形成菌体的最外层，与宿主发生直接反应。学者发现荚膜明显的菌株具有高亲水性、抵抗宿主血清杀伤、细胞吞噬等性质，较符合早期发现的侵袭性高毒菌株的特点，由此认为荚膜与P.gingivalis高毒菌株存在明显关联。研究表明不同P.gingivalis菌株的生物学性质和毒力性质存在广泛差异，不同、甚至相同K血清型的P.gingivalis菌株毒力的差异，可能是不同的荚膜化程度通过影响荚膜相关的生物学性质所造成的。荚膜更明显的菌株显示出自凝集作用减弱，浮力密度下降，更具亲水性，对多形核白细胞吞噬和血清杀伤的抵抗作用增强，活化替代补体途径的能力下降，还可能作为物理性屏障保护内面的脂多糖不激活补体级联反应，从而避免被宿主的调理和吞噬作用所清除，保护菌体避免或减少受溶菌酶、抗菌抗体、抗菌药物等有害物质的损伤。此外，荚膜相关的遗传异质性是细菌相关生物学性质和毒力性质差异的物质基础。基于P.gingivalis W83的基因组测序研究，学者们发现了多重潜在的多糖合成基因岛，但这些基因岛的功能并不完全明了。还有研究通过失活某些荚膜相关基因，观察到基因敲除株表现有多糖合成异常，在荚膜厚度、表面结构、生物学性质上发生了改变。目前，P.gingivalis致病性和荚膜的关系已引起国外学者的广泛关注，而国内尚未见报道。 本研究将利用前期从我院牙周科门诊分离得到的5株P.gingivalis临床菌株，分别命名为SJD2、SJD4、SJD5、SJD11、SJD12，以高毒力且荚膜明显的模式菌株W83及低毒力且不表达荚膜K抗原的模式菌株ATCC33277为对照，从生长、形态、生化代谢等生物学特性，以及荚膜相关的病原相关性质等表型特性，对7株P.gingivalis菌株的多样性进行研究。另外，从荚膜相关功能基因和基因岛的遗传多态性，以及基因表达水平和基因功能等方面，对P.gingivalis菌株荚膜相关的遗传多样性进行分析。初步探讨不同P.gingivalis菌株荚膜与其致病性间的关系，为牙周病病因学研究和生物治疗模式提供理论依据。 本研究第一部分通过光学显微镜观察了7株P.gingivalis菌株的菌体形态，比较了各菌株的生长速度，并使用API20A和ATB Rapid ID32A生化代谢反应检测系统检测分析各菌株的生化代谢反应，对P.gingivalis临床菌株生物学特性的多样性进行了研究。在光学显微镜和透射电镜观察各菌株荚膜结构和厚度的基础上，检测和比较了各菌株与细菌粘附定植相关的表面疏水性质，生成生物膜的能力，凝集红细胞的能力，牙龈素的活性；以及与细菌逃避宿主防御相关的耐受血清杀伤和抗生素的能力，对P. gingivalis临床菌株荚膜相关致病性质的多样性，以及与荚膜厚度和菌株毒力性质之间的关系进行了研究。 本研究第二部分通过对fimA基因的全长测序和遗传进化树的构建，分析P.gingivalis菌株fimA基因型和荚膜厚度的关联。在对P.gingivalis各菌株的荚膜相关基因和基因岛的同源比对分析的基础上，通过模拟限制性片段长度多态性分析和基因序列比对，分析了菌株间PG0106-PG0120基因岛的高度异质性。此外，采用实时定量PCR检测了PG0435-PG0437基因岛的表达水平，并尝试插入失活PG0435基因来分析PG0435基因的功能。探讨P.gingivalis菌株荚膜相关的遗传多样性。 结果如下： 1.P.gingivalis临床菌株的生长速度、菌体形态、生化代谢等表型特征呈现了与模式菌株的同质性，菌株间仅存在个别差异。P.gingivalis菌株以多肽或者氨基酸作为主要碳源或氮源，但存在部分糖代谢的能力。此外，ATB Rapid ID32 A可能更适合用于龈下菌斑中革兰氏阴性厌氧菌的生化反应检测和鉴定。 2.P.gingivalis菌株的荚膜厚度各异，与细菌毒力性质间未表现出明显相关性。荚膜的厚度与细菌表面亲疏水性质和自凝集反应、及逃逸血清杀伤等性质在一定程度上相关联，荚膜较厚的菌株显示出更强的表面亲水性、不易发生自凝集反应、并且更易逃逸宿主补体的杀伤；但是荚膜厚度并未与P.gingivalis形成生物膜、凝集红细胞、牙龈素活性等性质表现有明显关联。 3.受试的P.gingivalis菌株对临床常用的抗生素或抗生素配伍均敏感。 4.fimAⅠ型和Ⅰb型菌株的荚膜较薄；fimAⅡ型和Ⅲ型菌株的荚膜较厚，提示fimA基因型的差异可能与荚膜的厚度存在一定程度的关联。 5.大部分荚膜相关基因及荚膜相关基因岛PG1135-PG1142、PG0435-PG0437和PG1560-PG1565在P.gingivalis菌株间的异质性较小，均较为保守。但各菌株间基因岛PG0106-PG0120的异质性明显，该基因岛部分基因的缺失、同源基因的替代、个别基因的插入可能是造成各菌株荚膜厚度差异的原因。 6.SJD2和SJD5在生物学性质和遗传背景上均表现为高度一致性，但其毒力性质相反。 7.P.gingivalis各菌株不同生长时期PG0435-PG0437基因岛相对表达水平与荚膜厚度间未显示有关联。PG0435基因可能是P.gingivalis的必须基因，但仍需要进一步验证。 综上所述，P.gingivalis菌株间荚膜相关的表型特征和基因背景具有多样性。P.gingivalis荚膜的厚度与一些以往认为荚膜相关的生物学性质间并未显示出相关性，且与菌株的毒力性质的高低也无明显关联。因此，荚膜可能并非P.gingivalis的主要毒力因子，其在细菌生存、繁殖等方面的生物学作用，以及是否或如何参与细菌的毒力作用有待深入研究。