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自组装单分子膜具有制备简单、分子有序度高、可在分子水平上按预期目标进行膜性质调控等优点,因此,自组装单分子膜在电催化、电化学传感器、蛋白(酶)电化学等众多领域引起了人们广泛的关注。尽管端基为-COOH和-SO3H自组装单分子膜的性质以及电活性生物分子在其界面上的直接电化学已被广泛而深入的研究,但关于端基为-PO3H2自组装单分子膜的性质及其在生物电化学领域的应用研究非常稀少。鉴于细胞膜上含有有机磷酸(或脂)基团,构建-PO3H2端基自组装单分子膜仿生界面,研究电活性蛋白在-PO3H2端基自组装单分子膜界面上的电化学行为,理解磷酸基官能团的生物功能,将为从分子水平上认识细胞膜的基本行为提供理论依据和可靠方法。本文围绕这一研究主题,开展了以下几个方面的工作。
⑴巯基丙膦酸自组装单分子膜的制备及其界面性质。键合于Au表面的巯基丙膦酸硫醇盐与溶液中巯基丙膦酸分子之间的-PO3H2官能团间的氢键作用可导致二次吸附层形成。利用强碱溶液中-PO32-物种间的静电排斥作用,提出了碱-酸洗涤方式制备-PO3H2端基单分子膜的新方法。在巯基丙膦酸自组装单分子膜的形成过程中,-PO3H2端基的解离度影响巯基丙膦酸自组装单分子膜的覆盖度,因而,具有不同致密性的巯基丙膦酸自组装单分子膜可通过控制-PO3H2官能团的解离度来制备。与-COOH端基自组装单分子膜相似,-PO3H2端基自组装单分子膜的表面电荷不仅受溶液pH影响,也受界面电场的影响。由于巯基丙膦酸自组装单分子膜的结构受溶液pH影响较大,因此,电化学滴定方法不能测定单组分巯基丙膦酸自组装单分子膜的表面pKa值。
⑵细胞色素c在膦酸界面上的直接电子转移。细胞色素c(cyt c)是一个膜外周蛋白,位于磷脂组成的线粒体内膜的外表面。Cyt c能够成功地以静电作用方式固定于-PO3H2端基的自组装单分子膜表面。固定的cyt c保持其天然结构并实现其直接电子转移,表明-PO3H2端基的功能界面可以提供一个生物相容性的微环境。比较固定于巯基丙膦酸、巯基乙磺酸和巯基丙酸自组装单分子膜表面cyt c的电子转移速率,发现自组装单分子膜表面过高的负电荷不利于cyt c的直接电子转移。为了消除自组装膜端基官能团类型对固定的cyt c的电子转移的影响,我们提出了一个新策略来研究界面电场强度对cyt c电子转移的影响。3-膦酸基噻吩作为一个刚性轴向不对称分子,其自组装单分子膜的表面结构可以通过改变组装条件进行调控,由相同分子构成而表面结构不同的自组装单分子膜在恒定的pH条件下可显示出不同的电荷密度。我们以cyt c为模型分子,探测组装在由同一分子构成但表面结构不同的自组装单分子膜上的cyt c的电化学性质。电化学结果证实自组装单分子膜表面过高的电荷密度不仅不利于cyt c的直接电子转移,而且减低cyt c的表面覆盖度,这可能由于电极表面过高的负电荷和cyt c的强烈相互作用使cyt c在电极表面以不利于直接电子转移的取向排列。
⑶血红蛋白在膦酸化功能界面上的固定、直接电化学和电催化。实现了血红蛋白(Hb)在无电子媒介体情况下,在具有明确结构的非电活性自组装单分子膜上的直接电子转移。实验结果显示Hb在膦酸端基的自组装单分子膜上实现多层吸附,其天然结构不发生明显的变化,而且多层Hb能经蛋白-蛋白分子间的电子交换参与与电极间的电子转移。同时,观测到了Hb与自组装单分子膜内的膦酸基团间的作用本质不是静电作用,而是氢键相互作用。对于固定在膦酸端基的自组装单分子膜修饰的平面Au电极而言,低电位下自组装单分子膜内膦酸基团的电致质子化会导致吸附的Hb和膦酸基团间的氢键断裂,导致Hb在膦酸端基自组装单分子膜表面的脱附。当血红蛋白被固定在膦酸端基功能化的三维多孔Au电极后,相应的血红蛋白修饰电极显示出优良的电化学稳定性,热稳定性,快速的电子转移速率,极高的蛋白担载量和对H2O2优良的电催化活性,因此,有望构建第三代生物传感器。
⑷固定化的铁(Ⅲ)离子作为人工酶对过氧化氢的选择性测定。众多含有铁元素反应中心的氧化还原酶(蛋白)(例如辣根过氧化物酶,血红蛋白,肌红蛋白等),由于其对H2O2的高效的电催化性能,已经被使用来构建用于测定H2O2的电化学生物传感器。尽管酶(蛋白)传感器具有高选择性和灵敏度,但酶(蛋白)基传感器在实际操作中,酶(蛋白)的一些缺点会充分暴露出来,如酶(蛋白)非常昂贵,酶(蛋白)的活性随时间降低,在固定化过程中易变性,受温度、湿度、pH值、有毒物质的影响较大。由于蛋白质的不稳定性使酶基传感器的长期稳定性变差,极大地限制了酶基生物传感器的应用。本章中,我们发现在界面固定化的Fe(Ⅲ)离子具有类似于天然过氧化物酶的催化活性,且其电化学性质与酶修饰电极的十分相似。因Fe(Ⅲ)离子直径较生物蛋白质分子小很多,因而Fe(Ⅲ)离子在修饰电极表面的担载量远大于蛋白质担载量,同时,固定化的铁(Ⅲ)离子表现出快速的电子转移速率和优良的选择性响应,对H2O2显示出优良的电催化活性。另外,极为重要的是Fe(Ⅲ)离子作为无机物质,比生物分子(蛋白,酶)更加稳定,其价格远远低于生物分子(蛋白,酶),因此,本工作提出的新型传感器有望取代酶基生物传感器,更具产业化的潜力。