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蛇毒类凝血酶降解纤维蛋白原而不引起血液凝固,因此能降低血浆纤维蛋白原的浓度,在体内起到抗凝血作用,在临床上可用于治疗中风等病症。类凝血酶在尖吻蝮毒液中的含量尤为丰富,并以大量的同工酶形式存在。蛇毒类凝血酶属于丝氨酸蛋白酶家族,在结构和功能上呈现一定的多样性。目前对于蛇毒类凝血酶的分子结构、结构与功能关系以及多样性的形成机理的了解尚处于发掘数据和分析推测阶段。
由于分子生物学的发展以及测序手段以及一些生物软件的开发使用,极大地提高了人们对基因序列的分析效率。现在可以容易地比较各种序列,分析它们之间的联系和差别,或者分析序列变化的可能原因。对于基因密码运用方式的研究,可以帮助了解基因组里承受的突变压力,翻译效率选择性的作用,以及预测某些生物里基因的表达水平。
本实验以尖吻蝮毒液总RNA的反转录产物为模板,根据己知类凝血酶的氨基酸序列或cDNA序列设计引物,PCR扩增得到一个约700bp的条带。回收此条带并克隆至T载体,测序获得一系列的类凝血酶cDNA,其中部分序列已提交GeneBank被接受。在比较分析尖吻蝮毒液类凝血酶分子的一级序列时发现,其分子结构呈现出高度的多样性和保守性。其类凝血酶分子的长度、催化部位氨基酸残基的位置、二硫键的数目及位置十分保守;而在这些位置以外发生的突变概率相当高。其密码子的使用方式说明类凝血酶在长期进化过程中受到碱基组成的限制与自然选择的压力。我们推测,在进化过程中,蛇毒类凝血酶与胰蛋白酶皆来自于同一基因,蛇毒类凝血酶通过突变往适应毒蛋白的方向进化。表现为新二硫键的产生更有利于维持蛋白的高级构象,分子的多样性可以适应复杂的捕食对象等。蛇毒类凝血酶的密码子使用方式从另一方面揭示了这一进化特性的存在。
目前,国内尚无单一组分的类凝血酶产品,所生产的酶制剂系从蛇的毒液中用生化方法提取,都是以类凝血酶为主要成分、含有多个组分的复合酶制剂。
由于质量或纯度不高,有时也会产生毒副作用。相比之下,若采用基因工程方法生产酶制剂,则药物成分单一可靠,疗效更为确切,无出血等毒副作用,而且可以缩短生产周期,降低生产成本。本实验将以尖吻蝮毒液总RNA的反转录产物为模板所扩增出的产物与融合硫氧还蛋白的载体pBAD/Thio-TOPO相连接,成功地在大肠杆菌中诱导表达出了目的蛋白。该表达系统不仅提供了基因工程生产类凝血酶制剂的途径,同时也为分析各种类凝血酶结构与功能的关系提供了良好的试验体系。目前,蛇毒类凝血酶的非融合表达尚未见成功报道。本实验针对蛇毒类凝血酶非融合表达困难的这一现象,通过优化设计重组质粒pBV220-TLE,对其一级结构与表达的关联特性进行了初步研究。通过尖吻蝮毒液类凝血酶的异源表达研究我们发现,影响类凝血酶表达的关键因素在于其mRNA的二级结构,而具体二级结构是如何作用的还有待于进一步的实验加以验证。