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研究目的探索胆汁酸核受体（Farnesoid X receptor,FXR）在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）中的表达情况及促癌作用机制;研究FXR对肿瘤细胞表达PD-L1的调控及潜在联合用药前景。研究方法1.免疫组化法在NSCLC组织中检测FXR的表达情况,并分析与患者总生存期和临床病理特征的关系。2.采用FXR抑制剂Z-guggulsterone或特异性si RNA抑制蛋白表达,构建稳定干扰或高表达FXR的NSCLC细胞株。观察FXR对肿瘤细胞增殖、细胞周期、凋亡、以及裸鼠皮下移植瘤生长的影响;利用Western blot研究FXR对细胞周期蛋白的影响。采用FXR靶基因小异二聚体蛋白（Small heterodimer partner,SHP）特异性si RNA抑制蛋白表达,探索SHP是否参与FXR对肿瘤细胞增殖和周期蛋白的调控。3.染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）技术和荧光素酶生物发光法检测FXR与cyclin D1启动子的结合效应和激活效应。通过补救实验研究cyclin D1与FXR在NSCLC细胞中功能的关联。免疫组化法在相同NSCLC样本中检测cyclin D1的表达情况,并分析与FXR表达的相关性。4.检测FXR对NSCLC细胞表达PD-L1的影响,在相同NSCLC样本中检测PD-L1与FXR表达的相关性。在小鼠肺癌、结肠癌、黑色素瘤等肿瘤细胞中检测mus FXR的表达,并探究其对肿瘤细胞表达mus PD-L1的影响。利用SHP特异性si RNA抑制蛋白表达,探索SHP是否参与FXR调节肿瘤细胞表达PD-L1;利用Ch IP技术检测FXR与PD-L1启动子的结合效应;检测FXR对磷酸化EGFR的影响,并采用相应抑制剂处理,探索FXR是否通过磷酸化EGFR调控PD-L1的表达。研究结果1.共160例NSCLC患者纳入研究。免疫组化评分显示,FXR在肿瘤组织中表达量显著高于癌旁肺组织（P<0.001）。FXR蛋白表达量与患者TNM分期和肿瘤最大径显著相关（均P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析提示,FXR高表达组总生存期显著低于FXR低表达组（P=0.0032）。Cox多因素比例风险模型评估显示,FXR对患者总生存期具有较好的独立预测价值（Hazard ratio[HR]1.71,95%CI 1.108-2.637;P=0.015）。2.NSCLC细胞H1975和H1299表达FXR较高,而HCC4006表达FXR较低。抑制FXR可显著抑制H1975和H1299细胞增殖,并且降低增殖标志物Ki-67的表达;相反,过表达FXR则促进HCC4006细胞增殖和Ki-67的表达。动物实验发现,抑制FXR可显著抑制裸鼠移植瘤生长。抑制FXR可使NSCLC细胞出现G0/G1期阻滞,而对细胞凋亡无明显影响。Western blot结果显示,抑制FXR可明显降低细胞周期蛋白cyclin D1和磷酸化Rb（phosphorylated Rb,p-Rb）的表达;相反,过表达FXR则促进cyclin D1和p-Rb的表达。采用特异性si RNA抑制SHP蛋白对细胞增殖和cyclin D1、p-Rb表达无明显影响,表明FXR对NSCLC细胞增殖和周期蛋白的调控不依赖SHP。3.Ch IP结果表明,FXR可与NSCLC细胞cyclin D1启动子IR-0区段直接结合。荧光素酶实验显示,FXR促进cyclin D1转录活性增强。除此之外,过表达cyclin D1可显著逆转FXR-si RNAs对细胞增殖和周期的抑制效应。免疫组化结果显示,肺癌组织中cyclin D1与FXR表达有显著正相关性（P<0.001）。Kaplan-Meier生存分析显示,cyclin D1和FXR均高表达的患者其总生存期最差（P=0.0077）。4.抑制FXR可促进NSCLC细胞表达PD-L1;相反,过表达FXR则降低PD-L1的表达。免疫组化结果显示,肺癌组织中PD-L1与FXR表达存在显著负相关（P<0.05）。小鼠黑色素瘤细胞S91表达mus FXR较高;采用特异性si RNA抑制mus FXR蛋白可显著促进mus PD-L1的表达。抑制SHP对NSCLC细胞表达PD-L1无明显影响,表明FXR对PD-L1的调控不依赖SHP。Ch IP结果表明,FXR可与PD-L1启动子直接结合。除此之外,FXR可通过抑制磷酸化EGFR（Tyr1068）进而降低PD-L1的表达。研究结论本研究首次系统探索了FXR在NSCLC中的表达和功能,发现FXR在NSCLC中表达增高,与不良预后密切相关,是独立的预后因子;FXR可通过直接转录激活周期蛋白cyclin D1,进而促进NSCLC细胞周期进展和肿瘤增生。除此之外,FXR可通过直接转录调控和影响磷酸化EGFR表达两种方式,负性调控肿瘤细胞表达PD-L1。本研究部分揭示了FXR在NSCLC发生发展中的生物学作用,提供了一个潜在预后指标和治疗靶点。